携带IBV基因真核表达质粒的大肠杆菌工程菌发酵工艺研究

论文摘要

本研究以本课题组构建的携带鸡传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达质粒（pVAX1-S1、pVAX1-M、pVAX1-N、VR1020-S1、VR1020-M、VR10200N）的大肠杆菌基因工程菌为研究对象,对其发酵工艺进行了研究。采用单因子分析和正交设计,摇瓶发酵对各重组大肠杆菌的培养基条件进行了研究,确定优化了培养基的成份。发酵后,以优化的碱裂解法提取质粒,产量最高可达27.8mg/L,纯度达到1.88,是未优化前质粒产量的2.62倍。研究了携带鸡传染性支气管炎病毒真核表达质粒基因工程菌在5L发酵罐中的发酵工艺。优化了上罐发酵接种量、培养温度、初始pH及溶氧等培养条件。确定了优势菌株pVAX1-M,以优化的碱裂解法提取质粒产量可达57mg/L,纯度达到1.88,是未优化前质粒产量的4.3倍。对发酵液用热激法和碱裂解法两种不同的提取方法进行粗提,对碱裂解法进行优化,对裂解时间和裂解反应液的比例进行研究。再用聚乙二醇和硅藻土两种方法进行纯化,建立了以碱裂解法粗提,硅藻土法纯化的质粒DNA提纯工艺。该工艺可去除大部分RNA、基因组DNA和蛋白质等杂质,提取的质粒DNA纯度可达到1.88,超螺旋比例达到98.4%,符合世界卫生组织关于质粒产品的质量要求。对发酵罐发酵的菌体以本工艺提纯,质粒产量可达到57mg/L。与传统纯化方法比较,生产成本降低了20-40%。本研究降低了基因工程菌发酵和质粒提取的生产成本,为DNA疫苗的大规模生产提供了理论和实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1、前言
• 1.1 鸡传染性支气管炎的研究概况
• 1.2 鸡传染性支气管炎DNA疫苗的研究进展
• 1.3 大肠杆菌基因工程菌DNA疫苗的工艺研究进展
• 1.3.1 影响质粒DNA产量的因素
• 1.3.2 影响大肠杆菌基因工程菌高密度发酵因素
• 1.4 大肠杆菌质粒DNA提取、纯化工艺研究进展
• 1.4.1 大肠杆菌质粒DNA提取工艺研究进展
• 1.4.2 大肠杆菌质粒DNA纯化工艺研究进展
• 1.4.3 质粒DNA质量评价标准
• 1.5 存在问题
• 1.6 本研究的前期工作基础
• 1.7 本研究的目的意义和创新点
• 2、技术路线
• 3、试验材料
• 3.1 菌株和质粒
• 3.2 培养基、试剂及配制
• 3.2.1 培养基
• 3.2.2 试剂及配制
• 3.2.3 其它试剂
• 3.3 主要仪器
• 4、方法
• 4.1 两种质粒的鉴定
• 4.1.1 pVAX1-S1、M、N重组质粒的鉴定
• 4.1.2 VR1020-S1、M、N重组质粒的鉴定
• 4.2 6株大肠杆菌基因工程菌发酵工艺研究
• 4.2.1 6株大肠杆菌基因工程菌摇瓶发酵培养基的筛选
• 4.2.2 6株大肠杆菌基因工程菌发酵罐发酵培养条件的筛选
• 4.3 质粒DNA提取、纯化工艺研究
• 4.3.1 质粒DNA提取工艺
• 4.3.2 质粒DNA纯化工艺
• 4.3.3 质粒DNA的质量评价
• 5、结果与分析
• 5.1 两种质粒鉴定结果
• 5.1.1 pVAX1-S1、M、N重组质粒的鉴定结果
• 5.1.2 VR1020-S1、M、N重组质粒的鉴定结果
• 5.2 6株大肠杆菌基因工程菌发酵工艺研究
• 5.2.1 6株大肠杆菌基因工程菌摇瓶发酵培养基
• 5.2.2 6株大肠杆菌基因工程菌发酵罐发酵培养条件
• 5.3 质粒DNA提取、纯化工艺研究
• 5.3.1 质粒DNA提取
• 5.3.2 质粒DNA纯化
• 5.3.3 质粒DNA质量评价
• 5.3.4 纯化后质粒DNA成本
• 6、讨论
• 6.1 大肠杆菌基因工程菌发酵工艺研究
• 6.1.1 摇瓶筛选培养基
• 6.1.2 发酵罐筛选培养条件
• 6.2 质粒DNA提取、纯化工艺研究
• 6.2.1 质粒DNA提取
• 6.2.2 质粒DNA纯化
• 7、结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文