甘蓝EST-SSR标记开发及应用

论文摘要

结球甘蓝（Brassica oleracea var. capitata L.）（以下简称甘蓝）是十分重要的十字花科芸薹属蔬菜作物,在我国蔬菜周年供应和出口贸易中处于重要地位。随着分子生物学的快速发展,分子标记技术在遗传图谱绘制、重要农艺性状基因定位、生物遗传多样性分析、遗传进化分析、品种鉴定等方面得到广泛应用。其中,简单重复序列（Simple sequence repeat, SSR）标记技术因多态性高,易检测,共显性和特异性明显等特点应用更加普遍。鉴于已公开报道可用的甘蓝SSR标记数量较少,本研究基于NCBI数据库公开报道的62,576条与甘蓝相关的EST,研究开发了EST-SSR标记,并将其应用于甘蓝指纹图谱构建、杂交种纯度鉴定、与甘蓝显性雄性不育基因连锁的分子标记等。主要研究结果如下1、甘蓝EST-SSR特征及扩增分析。利用SSRIT在线分析软件（http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool）对19,611条无冗余甘蓝EST进行了搜索,共得到1,219条SSR,分布在1,176条EST上,分布密度为1/11.48kb,包括273种重复基元。其中,二核苷酸（353个SSR）和三核苷酸（423个SSR）占主导地位；出现最多的重复基元是AG/CT,占总数的25.59%,其次为AAG/CTT占7.71%；其它重复类型所占比例均不足5%。基于1,176条含有SSR的EST,设计合成了978对甘蓝EST-SSR引物。以早熟圆球型甘蓝397和晚熟扁圆球型甘蓝20-2-5两份自交系为试材,对合成引物进行初步的扩增分析,其中897对引物有扩增产物,共扩增出1,026条扩增带；128对引物在两份材料间表现出多态性,共扩增258条多态性带（占总带数的25.15%）。表明开发的EST-SSR引物在甘蓝上有较好的可用性。2、构建了部分甘蓝品种的指纹图谱并进行“京丰1号”的纯度鉴定。在对甘蓝EST-SSR初步扩增分析的基础上,利用BoE002.BoE222.BoE225和BoE916等4对引物构建了“中甘11”、“8398"、“中甘15”和“中甘21”等4个春甘蓝及其亲本的EST-SSR指纹图谱；利用BoE974.BOE9]6.BoE337.BoE316和BoE222等5对引物构建了“京丰1号”、“晚丰”、“中甘8号”、“中甘18”、“中甘19”和“中甘22”等6个秋甘蓝及其亲本的EST-SSR指纹图谱。利用能够扩增出互补带型的标记BoE222进行“京丰1号”杂交种的分子鉴定,种子纯度鉴定为90%,与田间鉴定结果吻合率约为98%。3、获得了与早熟圆球型甘蓝显性雄性不育基因CDMs399-3连锁的分子标记。以来自早熟圆球甘蓝397育性分离群体的5株可育株及4株纯合不育株分别构建可育池和不育池,并以该群体的敏感不育单株自交得到的73株F2分离群体的植株为试材,筛选与早熟圆球甘蓝显性雄性不育基因连锁的标记,结果得到共显性标记BoE332（不育片段约270bp,可育片段约290bp）,该标记与显性雄性不育基因CDMs399-3连锁距离为3.6cM,可应用于纯合不育单株的快速鉴定,加速了397显性雄性不育系的选育进程。

论文目录

• 英文缩略表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 DNA分子标记概述
• 1.2 EST标记及其开发
• 1.2.1 EST标记概述
• 1.2.2 EST标记的开发策略
• 1.3 EST-SSR标记的特点及研究现状
• 1.3.1 EST-SSR标记
• 1.3.2 EST-SSR的特点
• 1.3.3 EST-SSR的应用
• 1.4 DNA指纹图谱
• 1.4.1 植物DNA指纹技术概述
• 1.4.2 甘蓝DNA指纹图谱研究
• 1.5 甘蓝显性雄性不育基因分子标记研究
• 1.5.1 甘蓝显性核基因雄性不育的遗传
• 1.5.2 甘蓝显性雄性不育基因分子标记
• 第二章 甘蓝EST-SSR标记的开发
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料和模板DNA的提取
• 2.1.2 甘蓝EST来源及EST-SSR的发掘
• 2.1.3 EST-SSR的引物设计
• 2.1.4 SSR扩增分析
• 2.2 结果和分析
• 2.2.1 甘蓝EST-SSR出现的频率和特点
• 2.2.2 甘蓝EST-SSR基序长度及重复次数分布
• 2.2.3 甘蓝EST-SSR标记的扩增分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 甘蓝EST-SSR的分布特征
• 2.3.2 甘蓝EST-SSR标记的应用性
• 第三章 部分甘蓝品种DNA指纹图谱构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试材料和DNA的提取
• 3.1.2 SSR分析
• 3.1.3 数据分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 甘蓝品种DNA指纹图谱构建
• 3.2.2 杂交种纯度鉴定
• 3.3 讨论
• 第四章 与早熟圆球甘蓝显性雄性不育基因连锁的EST-SSR标记
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 分离群体及BSA池的构建
• 4.1.2 育性调查及纯合不育株鉴定
• 4.1.3 SSR分析
• 4.1.4 数据分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 田间育性调查
• 4.2.2 SSR标记筛选
• 4.2.3 与甘蓝显性细胞核雄性不育基因连锁遗传的分析
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历