神经生长因子对脂多糖诱导的成骨细胞炎症反应的影响

论文摘要

目的:研究外源性神经生长因子（NGF）对脂多糖（LPS）诱导的成骨细胞炎症反应及相关基因表达的影响。方法:取新生1d龄的SD大鼠行成骨细胞的分离及培养,采用“多次贴壁法”纯化成骨细胞及传代,采用Von Kossa’s矿化结节染色法进行成骨细胞鉴定。取原代培养第2代末的成骨细胞,用EDTA（0.01%）-胰蛋白酶（0.125%）消化,将细胞重悬于含10%胎牛血清的α-MEM培养基中,调整浓度为1×105个/cm3传代于细胞培养瓶中。待细胞长至90%融合时可进行实验。采用不同浓度的LPS作用24h,对照组给予等体积空白溶媒。MTT法检测LPS对细胞活力的影响,确定LPS作用浓度。采用含不同浓度的神经元条件培养液（neuron conditioned medium,NCM;分别用培养基稀释5、10和20倍）或者NGF（100ng/ml,10ng/ml和1ng/ml）的α-MEM培养基,并加入LPS（1μg/ml）,阴性对照给予等体积空白溶媒,分别作用2h、12h和24h后,应用一氧化氮（NO）检测试剂盒测定细胞上清液中NO浓度,MTT法检测细胞活力;按试剂盒说明进行总RNA提取和逆转录反应,采用SYBR GREEN法进行定量PCR检测TNF-α、COX-2和NF-κB mRNA的表达。结果:MTT结果显示,10、5及2.5μg/ml LPS作用24h,细胞活力与对照组相比显著增加,而1.25μg/ml及以下浓度则不影响细胞活力。采用1μg/ml LPS分别作用细胞1h、2h、6h、12h及24h,发现随着作用时间延长,胞外NO浓度不断升高,与对照组相比,在6h具有显著差异,12h和24h具有极显著差异。因此选用1μg/ml LPS为造模浓度。1μg/ml LPS作用2h后,各组成骨细胞NO释放与对照组相比无明显变化。1μg/ml LPS作用12h和24h可导致成骨细胞NO释放显著升高（p<0.05,p<0.01）。与LPS组相比,1/10浓度NCM在12h时间点可显著抑制成骨细胞NO释放（p<0.05）,1/20、1/10及1/5浓度NCM在24h时间点均可显著抑制成骨细胞NO释放（p<0.05,p<0.01,p<0.01）。与对照组相比,1μg/ml LPS及不同浓度NGF作用2h时对成骨细胞NO释放无明显变化。1μg/ml LPS作用12h和24h后,成骨细胞NO释放显著高于对照组。与LPS组相比,100ng/ml NGF在12h和24h时间点可显著抑制成骨细胞NO释放,10ng/ml NGF在24h时间点可显著抑制成骨细胞NO释放。在此药物作用浓度范围内,细胞活力不受影响。与对照组相比,在2h、12h和24h时间点,LPS组TNF-αmRNA表达显著升高。与对应时间点LPS组相比,NGF高中剂量组在2h时可显著抑制TNF-αmRNA表达。NGF高中低剂量组在12h时均可显著抑制TNF-α、COX-2和NF-κB mRNA表达。结论:NGF可通过抑制成骨细胞产生NO,减少炎症介质的释放,同时可抑制成骨细胞TNF-α、COX-2和NF-κB的mRNA表达,减轻炎症级联反应,发挥抗炎作用。

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