论文摘要
目的:卵巢癌患者对化疗产生耐药性是影响疗效的主要原因之一。传统的逆转剂因副作用大而使得临床应用受到限制,因此寻找高效、低毒的逆转剂是目前研究方向及热点之一。重组改构人肿瘤坏死因子（recombinant mutant human tumor necrosis factor, rmh-TNF）是由国内学者通过蛋白质工程技术改造天然TNF的结构而研制出的一种高效、低毒的TNF突变体。本研究通过体外实验观察rmh-TNF对人卵巢癌多药耐药细胞系SKOV3/DDP耐药性的影响,并对可能存在的机制进行初步的探讨,以期寻找一种新的药物帮助解决卵巢癌治疗中出现的多药耐药问题。方法:体外培养人卵巢癌多药耐药细胞株SKOV3/DDP,采用四氮唑噻蓝盐（MTT）比色法检测rmh-TNF对SKOV3/DDP耐药株的细胞毒作用,选择杀伤率<10%的浓度作为该药物的无毒剂量,即本实验的逆转剂量。同法测定逆转剂量的rmh-TNF干预后细胞株SKOV3/DDP对顺铂耐药性的变化;应用流式细胞术（FCM）检测rmh-TNF干预不同时间段SKOV3/DDP细胞株中GST-π蛋白、BCL-2蛋白的表达,应用逆转录酶链反应（RT-PCR）分析rmh-TNF处理SKOV3/DDP细胞前后mdr1 mRNA、BCL-2 mRNA的表达水平。结果:1 MTT结果显示: rmh-TNF在（50-3200）U/ml以内能抑制SKOV3/DDP细胞的体外增殖,且随着浓度增加抑制率相应上升。回归分析得出当rmh-TNF终浓度<122.34U/ml,其对细胞生长无明显抑制作用（细胞存活率均﹥90%）因此本实验选用100U/ml作为逆转剂量。100U/ml rmh-TNF作用SKOV3/DDP 24、48、72h的逆转倍数分别为1.19倍、2.20倍、2.64倍。2流式细胞术检测结果显示rmh-TNF处理前SKOV3、SKOV3/DDP两组细胞GST-π蛋白表达量的相对值（FI）分别是1、2.33±0.30,两株细胞GST-π蛋白的表达具有极显著性差异（P<0.01）,100U/ml rmh-TNF作用细胞SKOV3/DDP 24、48、72h后GST-π蛋白表达量的相对值随作用时间的延长而逐渐降低,FI值分别为1.82±0.13、1.73±0.28、1.31±0.17,作用前后比较均有显著性差异（P<0.05）;rmh-TNF处理前SKOV3、SKOV3/DDP两株细胞BCL-2蛋白表达量的相对值（FI）分别是1、2.62±0.15,两株细胞BCL-2蛋白的表达具有极显著性差异（P<0.01）,100U/ml rmh-TNF作用细胞SKOV3/DDP 24、48、72h后BCL-2蛋白表达量的相对值随作用时间的延长而逐渐降低,FI值分别为2.24±0.20、1.71±0.19、1.30±0.15,作用前后比较均有显著性差异（P<0.05）。3 RT-PCR法检测结果显示rmh-TNF处理前SKOV3细胞株不表达mdr1 mRNA, SKOV3/DDP细胞株mdr1 mRNA表达量的相对值（mdr1/β-actin）是0.76±0.01。100U/ml rmh-TNF作用细胞株SKOV3/DDP 24、48、72,mdr1 mRNA表达量的相对值随作用时间的延长而逐渐降低,mdr1/β-actin值分别为0.66±0.05、0.52±0.04、0.45±0.03,作用前后差异均有显著性。（P<0.05）;rmh-TNF处理前SKOV3、SKOV3/DDP两株细胞BCL-2 mRNA表达量的相对值（BCL-2/β-actin）分别是0.09±0.15、0.47±0.01,两株细胞BCL-2 mRNA的表达具有极显著性差异（P<0.01）,100U/ml rmh-TNF作用细胞SKOV3/DDP 24、48、72h后BCL-2 mRNA表达量的相对值随作用时间的延长而逐渐降低,BCL-2/β-actin值分别为0.45±0.01、0.31±0.01、0.27±0.01,作用前后比较均有极显著性差异（P<0.01）结论:1重组改构人肿瘤坏死因子（rmh-TNF）在（50-3200）U/ml浓度范围内,对SKOV3/DDP细胞有生长抑制作用,且呈浓度依赖性。2逆转剂量的重组改构人肿瘤坏死因子（rmh-TNF）对SKOV3/DDP细胞耐顺铂效应有一定的逆转作用,且逆转效应存在时间-效应关系。3逆转机制可能为:①逆转剂量的重组改构人肿瘤坏死因子（rmh-TNF）可能通过下调耐药相关基因mdr1 mRNA表达,进而降低SKOV3/DDP细胞的耐药性实现逆转耐药。②逆转剂量的重组改构人肿瘤坏死因子（rmh-TNF）可在转录和蛋白翻译水平降低BCL-2表达,进而降低BCL-2抑制凋亡的作用,使耐药细胞株凋亡增加,发挥对细胞耐顺铂效应的逆转作用。③逆转剂量的重组改构人肿瘤坏死因子（rmh-TNF）可能通过下调GSTπ表达,减少细胞毒性药物代谢产物的外排从而实现耐药性的逆转。
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