三磷酸腺苷对小鼠肌源性干细胞的作用及机理的实验研究

论文摘要

三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）是为细胞新成代谢提供能量的直接物质。近二十年来,一些研究发现,ATP还是一种重要的细胞外信号分子和营养因子,在中枢神经和周围神经系统中有神经递质的作用,而且能促进神经纤维的再生,延缓失神经肌肉的萎缩,调节细胞增殖和分化,与多种细胞的凋亡也有密切的关系。肌源性干细胞（Muscle-derived Stem Cells, MDSC）是从骨骼肌组织中分离出的一类新型干细胞,表达造血干细胞的表型Sca-1和CD34,能向多种组织分化,自我更新能力强,在细胞治疗和基因工程研究中其表现明显优于肌卫星细胞。本科室在前期工作中已经证实了局部注射ATP能延缓失神经肌肉萎缩,但其机理还未深入研究。本实验就此方面进行探讨。1.新生小鼠肌源性干细胞培养与鉴定:我们采用双酶（胶原酶XI和胰蛋白酶）消化法消化分离小鼠骨骼肌组织,用差速贴壁法纯化,成功地获得原代肌源性干细胞,进行免疫组化染色证实为Sca-1+/CD34+细胞,然后在高血清条件下进行传代增殖,了解其细胞生物学特性,在低血清条件下自主向成肌方向分化,形成肌管。从而证实小鼠骨骼肌组织中存在肌源性干细胞,它们能进行原代和传代培养,并能够增殖、分化、融合,形成新的肌纤维,修复骨骼肌的损伤。2.ATP对体外培养的肌源性干细胞的作用及机理:通过第一部分中细胞分离纯化方法获得肌源性干细胞,传代以便获得数量足够的细胞,然后在细胞培养基中加入ATP,通过MTT法,流式细胞学方法和RT-PCR检测ATP对肌源性干细胞的作用。结果显示ATP作用后第3天细胞增殖明显加快;S期的细胞比例（S%）及增殖指数PrI值[（S+G2M）%]增高,G1%降低,细胞周期及G1和S亚周期的时间缩短。RT-PCR检测到肌源性干细胞表达ATPR（P2Y1）,且ATP能够刺激P2Y1受体表达。因此,提出ATP在高血清条件下能促进肌源性干细胞增殖,它可能是通过P2Y1受体起作用。3.ATP对肿瘤坏死因子-α诱导肌源性干细胞凋亡保护作用的研究:利用TNF-α诱导肌源性干细胞凋亡,观察ATP对细胞凋亡的影响。通过流式细胞学方法检测细胞凋亡率,并检测细胞凋亡蛋白酶Caspase-3和Caspase-8的表达。结果显示,在TNF-α作用下,肌源性干细胞凋亡增加,ATP明显降低TNF-α诱导的细胞凋亡率,减少Caspase-3+和Caspase-8+细胞百分率。因此,提出ATP抑制Caspase-3和Caspase-8的表达,从而防止肌源性干细胞凋亡。4.ATP对在体骨骼肌MDSC的作用研究:按常规方法造成小鼠坐骨神经损伤模型,腓肠肌局部注射ATP,于术后不同时间点检测肌源性干细胞增殖情况。结果显示,在正常组和失神经组,局部注射ATP后,肌源性干细胞数量增加,肌肉组织中Sca-1的表达增高,Sca-1+细胞的百分比也升高,术后1周时达到最高,并一直持续到术后2周以后。因此,提出ATP能促进失神经肌肉肌源性干细胞增殖,从而延缓失神经肌肉萎缩。综上所述,我们利用细胞分离培养技术和神经损伤模型,采用免疫组织化学、流式细胞学、分子生物学等实验方法和技术发现ATP延缓失神经肌肉萎缩的机理之一是通过激活P2Y1受体,加强核酸和蛋白质的合成,缩短细胞周期,促进肌源性干细胞增殖,而且还能减少骨骼肌失神经后细胞的凋亡。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 小鼠骨骼肌肌源性干细胞培养与鉴定
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 ATP 对体外培养的肌源性干细胞的作用及机理
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第三部分 ATP 对TNF-α诱导肌源性干细胞凋亡保护作用的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第四部分 ATP 对在体骨骼肌肌源性干细胞的作用研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 骨骼肌干细胞研究进展
• 参考文献
• 致谢