基于二维电泳的蛋白质组学分析基础上的蛋白磷酸化研究

论文摘要

磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,对蛋白质磷酸化修饰的研究对解释生命现象的本质有着重要的意义。本研究在传统蛋白质组学研究的基础上,对从水稻叶片中提取富集检测磷酸化蛋白的方法进行了探索,提出了一套基于蛋白质谱鉴定结果的蛋白磷酸化预测方法和一套用于蛋白质点磷酸化检测的方案,为基于二维电泳分离技术的蛋白质学研究完成后进一步研究差异蛋白点磷酸化提供了可行的策略。本研究证实,在传统的TCA/丙酮沉淀法和苯酚抽提法都不能高效的从水稻叶片中提取磷酸化蛋白。用硫酸铵沉淀法降低水稻叶片全蛋白中的Rubisco后,二维电泳所能检测到的蛋白点明显增加,有可能提高低丰度磷酸化蛋白的提取效率。本研究摸索出了适合对溶解在高浓度尿素溶液中的磷酸化蛋白进行富集的方法,将其应用到水稻叶片磷酸化蛋白的富集上,并且用磷酸酯酶处理法在富集后的蛋白中检测到8对酶处理前后蛋白量发生变化的蛋白。此外,本研究提出了一套结合质谱鉴定结果对蛋白磷酸化进行预测的方法,并且将其应用到棉花胚珠发育过程差异蛋白点磷酸化预测中。该方法从50个差异点中,预测出了799个可能的磷酸化位点,并且对其磷酸化的可能性进行了评估。在此基础上,将50个蛋白点按照其预测出来的磷酸化位点信息对其磷酸化水平进行了分类。最后,本文提出了针对从二维凝胶上挖出来的蛋白点进行磷酸化鉴定的方案——基于磷酸酯酶处理鉴定法。标准样品测试证明,这套方案可以有效区分磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白。利用基于磷酸酯酶处理的鉴定方法从50个棉花胚珠发育过程差异蛋白点中发现了9个酶处理后迁移率发生变化的蛋白。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 课题概述
• 1.2 磷酸化蛋白质组学概述
• 1.2.1 蛋白质组学
• 1.2.2 磷酸化蛋白组学
• 1.2.2.1 蛋白质的磷酸化
• 1.2.2.2 磷酸化蛋白质组学
• 1.3 磷酸化蛋白质组学研究策略
• 1.3.1 磷酸化蛋白质组学的研究方式
• 1.3.1.1 从蛋白质到位点的研究顺序
• 1.3.1.2 从位点到蛋白质的研究顺序
• 1.3.2 磷酸化蛋白质组学研究的基本步骤
• 1.4 磷酸化蛋白质组学研究方法
• 1.4.1 磷酸化蛋白的预测
• 1.4.2 磷酸化蛋白（肽段）的制备
• 1.4.3 磷酸化蛋白（肽段）的富集
• 1.4.3.1 基于免疫沉淀反应的富集
• 1.4.3.2 基于物理吸附的富集
• 1.4.3.3 基于化学修饰的富集
• 1.4.4 磷酸化蛋白质（肽段）的分离
• 1.4.5 磷酸化蛋白（肽段）的鉴定
• 1.4.5.1 磷酸化抗体杂交法
• 1.4.5.2 磷酸化染料染色法
• 1.4.5.3 放射性同位素标记法
• 1.4.5.4 磷酸酯酶处理法
• 1.4.5.5 质谱法
• 1.4.6 磷酸化蛋白（肽段）的定量
• 1.5 研究方法与论文结构
• 第二章 水稻叶片磷酸化蛋白的提取与检测
• 2.1 本章引论
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 水稻叶片蛋白的提取
• 2.2.2.1 水稻幼苗的准备
• 2.2.2.2 TCA/丙酮沉淀法提取水稻叶片全蛋白
• 2.2.2.3 苯酚抽提法提取水稻叶片全蛋白
• 2.2.3 IMAC 技术富集水稻叶片磷酸化蛋白
• 2.2.3.1 IMAC 树脂的准备
• 2.2.3.2 IMAC 富集磷酸化蛋白的上样
• 2.2.3.3 IMAC 富集磷酸化蛋白的洗脱
• 2.2.4 磷酸化蛋白的检测
• 2.2.4.1 λ磷酸酯酶处理检测磷酸化蛋白
• 2.2.4.2 牛小肠碱性磷酸酯酶检测磷酸化蛋白
• 2.2.4.3 磷酸化蛋白二维电泳分析
• 2.2.4.4 磷酸化酪氨酸抗体检测磷酸化蛋白
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 水稻叶片全蛋白的提取及其磷酸化水平检测
• 2.3.1.1 水稻叶片全蛋白二维电泳图谱
• 2.3.1.2 水稻叶片全蛋白中Rubisco 蛋白的去除
• 2.3.1.3 TCA/丙酮法提取的水稻叶片全蛋白中磷酸化蛋白含量
• 2.3.2 IMAC 富集水稻叶片磷酸化蛋白
• 2.3.2.1 沉淀上样法富集磷酸化蛋白
• 2.3.2.2 稀释上样法富集磷酸化蛋白
• 2.3.3 磷酸酯酶处理法检测水稻叶片磷酸化蛋白
• 2.3.3.1 固定化牛小肠碱性磷酸酯酶处理法检测磷酸化蛋白
• 2.3.3.2 λ磷酸酯酶处理法检测磷酸化蛋白
• 2.3.3.3 水稻叶片全蛋白中的磷酸化蛋白
• 2.4 结果讨论
• 2.4.1 不同提取方法对水稻叶片磷酸化蛋白提取的影响
• 2.4.2 RUBISCO 对水稻叶片磷酸化蛋白提取的影响
• 2.4.3 IMAC 富集磷酸化蛋白
• 2.4.4 磷酸酯酶处理法鉴定磷酸化蛋白
• 2.4.5 水稻叶片中的磷酸化蛋白
• 第三章 基于蛋白鉴定结果的磷酸化预测
• 3.1 本章引论
• 3.2 原理与方法
• 3.2.1 磷酸化位点的预测
• 3.2.2 蛋白磷酸化水平预测
• 3.3 棉花胚珠发育过程差异蛋白质的磷酸化预测
• 3.3.1 棉花胚珠发育过程差异蛋白质磷酸化位点预测
• 3.3.2 棉花胚珠发育过程差异蛋白质磷酸化水平预测
• 3.4 结果讨论
• 3.4.1 蛋白质组学数据的进一步挖掘
• 3.4.2 磷酸化位点的预测
• 3.4.3 蛋白磷酸化水平
• 第四章 面向差异蛋白点的磷酸化筛选
• 4.1 本章引论
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料与试剂
• 4.2.2 基于磷酸酯酶处理的筛选
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 磷酸酯酶处理标准样品
• 4.3.2 棉花胚珠发育差异蛋白的筛选
• 4.4 结果讨论
• 4.4.1 面向差异蛋白点的磷酸化筛选
• 4.4.2 磷酸酯酶处理结合电泳检测磷酸化蛋白
• 4.4.3 棉花胚珠发育过程差异蛋白点的磷酸化筛选
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果