论文摘要
在正常生理状态下,哺乳动物细胞持续受到活性氧如超氧阴离子自由基、过氧化氢和羟自由基的攻击,这些活性氧产生于细胞中间代谢线粒体电子传递链,自然界中的射线及某些特定化学物质也可加速活性氧的产生。核酸、蛋白、脂类及糖类等细胞内大分子均面临不同程度的氧化损伤,由于核酸的氧化损伤可能引起遗传信息的改变,核酸氧化及其预防修复机制受到了人们的普遍关注。与DNA相比,RNA大部分都处于单链状态、较少受到氢键及特异蛋白的保护,因此,RNA更易于受到氧化损伤。体外（in vitro）研究结果显示,参与人体细胞RNA氧化抑制的基因主要有MTH1、NUDT5、YB1和PNP,其中MTH1、NUDT5具有水解8-羟基-鸟嘌呤核苷酸的活性,主要在核苷酸池水平上发挥清除作用；PNP、YB1则主要是在RNA链水平上发挥作用,它们可以与含有8-oxoG的RNA特异性结合。为深入研究哺乳细胞体内（in vivo）状态下上述基因的生物学功能,本研究应用RNA干扰（RNAi）等技术,着重分析了NUDT5基因表达被抑制后对细胞增殖、细胞周期以及老化等生理过程的影响,并对早衰模式小鼠Klotho基因缺陷鼠中NUDT5的表达及RNA氧化情况进行了研究。我们首先为参与RNA氧化抑制机制的上述基因分别设计合成了3条的siRNA,转染HeLa细胞后利用realtime RT-PCR筛选具有高干扰效率的至少一条siRNA序列。通过构建针对NUDT5基因的shRNA质粒并转染HeLa细胞,成功筛选到了稳定敲减NUDT5的单克隆细胞株。采用高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测shNUDT5细胞DNA和RNA中8-oxodG和8-oxoG的水平,与对照细胞相比,二者均未发生明显改变。流式细胞术检测显示,细胞敲减NUDT5后细胞活力下降,但细胞凋亡未受影响,细胞周期在G1/S期出现了明显阻滞。western blotting检测显示细胞周期G1期阻滞蛋白P53、P16、Rb的表达水平升高,p-Rb的水平下降。我们推测NUDT5敲减后细胞周期G1的阻滞可能主要通过上述蛋白发挥作用。采用低渗的方法向HeLa细胞中引入8-oxoGTP使RNA中的氧化水平特异性升高,以观察RNA氧化升高对细胞周期的影响。结果显示,RNA氧化水平的升高不能导致细胞周期G1/S的阻滞。为研究敲减NUDT5对原代细胞的影响,以pSIREN-RetroQ为载体成功构建了用于病毒转染的质粒,用HEK293T细胞成功包装针对NUDT5的shRNA逆转录病毒颗粒,侵染人原代细胞IMR-90成功筛选到了稳定敲减NUDT5的多克隆细胞株。利用CCK-8对细胞活力进行了检测,结果显示,NUDT5敲减后IMR-90细胞活力显著下降,,但与HeLa细胞内不同,流式细胞术检测显示NUDT5敲减以后细胞凋亡显著升高,细胞计数检测显示群体细胞倍增能力（PD）显著降低,β-gal检测显示细胞中老化指标β-gal的含量明显升高。这一结果提示,NUDT5基因不仅影响IMR-90细胞增殖和凋亡,同时还与其细胞老化相关。为进一步验证RNAi的实验数据,我们还成功构建了含有三个点突变位点的NUDT5 rescue病毒表达质粒,使该质粒产生的NUDT5 mRNA不会被siRNA识别。Klotho基因缺陷鼠可出现一系列与人类衰老相似的表型变化,为了研究核酸氧化及NUDT5蛋白可能在Klotho基因缺陷小鼠老化模型中的作用,我们采用免疫组化对小鼠海马中的核酸氧化水平及NUDT5蛋白表达水平进行了检测,结果显示,Klotho小鼠海马区DNA及RNA的氧化水平没有变化,NUDT5蛋白的含量也没有明显的变化。Klotho小鼠快速老化模型中,小鼠的快速老化与NUDT5蛋白及核酸氧化可能并无关联。本研究成功筛选到了核酸氧化抑制基因MTH1、MTH2、NUDT5、YB1和PNP的高干扰序列,为后续研究核酸的氧化抑制机制提供了实验依据,开拓了人们对于NUDT5蛋白的功能认识,为进一步研究RNA氧化及老化的防御机制奠定了基础。
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