论文摘要
目的:探讨镉和黄芪对大鼠睾丸支持细胞相关蛋白表达和血睾屏障的影响及可能机制。方法:①体内模型:采用21只雄性成年SD大鼠,平均体重为（180.7±2.2）g,随机分成镉组（0.1%氯化镉腹腔内注射,1mg/Kg体重/天,5天/周,于处理后1W、2W、3W、4W取材）;镉加黄芪组（同上方法注射氯化镉的同时注射黄芪10g/Kg体重/天,于处理后2W、4W取材）和对照组（腹腔内注射相同剂量生理盐水）。实验组每个时间段及对照组均为3只动物。大鼠睾丸白膜下固定后取材,分别作光镜、免疫组化（波形蛋白、E-钙粘蛋白）检测和电镜观察。另用6只大鼠分为镉处理（1W）组及对照组,硝酸镧灌注固定后作血睾屏障超微结构观察。②体外模型:采用16日龄SD雄性大鼠,睾丸经剪碎、消化、孵育、再消化、过滤后培养,获得纯度近95%的原代培养支持细胞。对照、镉（50μmol/L）、镉加黄芪（50μmol/L + 10mg/ ml）处理的原代培养大鼠睾丸支持细胞分别进行超微结构观察、免疫组化（波形蛋白、E-钙粘蛋白）检测及细胞内钙离子浓度测定。结果:①在体实验:光镜下H.E染色见对照组支持细胞核形不规则,染色浅,核仁明显。镉处理后,胞浆内有少许空泡形成,镉加黄芪组支持细胞未见明显改变。免疫组化结果显示,波形蛋白阳性产物主要在支持细胞胞浆中表达,并向曲细精管管腔呈辐射状延伸。镉处理后,阳性产物表达的平均光密度明显降低,随着染镉时间延长,呈辐射状延伸的阳性产物变短,甚至消失。镉加黄芪组其阳性产物表达强度明显高于相应镉组。E-钙粘蛋白阳性产物主要定位于曲细精管生精上皮近腔室的支持细胞和生精细胞胞浆中,单纯镉和镉加黄芪处理后E-钙粘蛋白表达的平均光密度改变与同样处理后的波形蛋白表达相似。电镜下,支持细胞呈不规则锥体形,细胞基部紧贴基底膜,核大,异染色质较少,核仁明显,胞浆内见丰富的内质网、线粒体等,相邻支持细胞侧面质膜形成紧密连接。镉处理后,支持细胞超微结构及特化区和紧密连接破坏明显,其损伤程度与染镉时间、剂量呈正相关;硝酸镧示踪显示,镧透过支持细胞间的紧密连接间隙,甚至进入曲细精管管腔。镉加黄芪处理后,支持细胞及紧密连接的改变较相应镉组为轻。②体外实验:电镜下原代培养细胞符合大鼠睾丸支持细胞形态学特征:即核多呈不规则形,凹陷深,核内异染色质少,核仁发达,其旁常见双极小体,胞质内线粒体、高尔基复合体、内质网和微丝等丰富。镉处理后线粒体肿胀,溶酶体增多,内质网扩张。受损严重的细胞可见胞质空泡,核异染色质凝聚或核碎裂。镉加黄芪处理组细胞破坏较轻。免疫组化结果显示,波形蛋白阳性产物密集环绕于支持细胞核周围,形成网状结构,E-钙粘蛋白阳性产物定位与波形蛋白相似。镉处理组两种蛋白的阳性产物表达均减弱,丝网状阳性产物稀疏、断裂。镉加黄芪组两种蛋白的阳性产物虽较对照组减弱但明显强于镉组（P<0.05）。对照、镉和镉加黄芪组细胞内钙离子浓度测定值分别为81.773±3.711、161.602±1.978、104.278±1.963。结论:本研究通过体内、外实验证实,微量重金属镉能减弱大鼠睾丸支持细胞波形蛋白和E-钙粘蛋白的表达,造成支持细胞及血睾屏障的损伤和破坏,同时增加支持细胞内钙离子浓度,而黄芪具有明显的保护作用。推测镉可能通过影响波形蛋白和E-钙粘蛋白表达,破坏支持细胞骨架系统和血睾屏障结构。黄芪能通过抑制钙离子内流或增强细胞内MAPKs活性、抗氧化等途径,拮抗镉对支持细胞的毒性作用。