竹虫（Omphis fuscidentalis）纤维素酶系的酶学性质及内切-β-1，4-葡萄糖苷酶的分离纯化

论文摘要

纤维素是自然界最为丰富的可再生能源，地球上每年光合作用生成的上亿吨生物质中，纤维素占了近一半，而实际上纤维素只有一小部分得到了利用。有效地利用这一可再生资源，将其转化为人类急需的能源，对于解决日益严峻的能源危机有着重大的现实意义。利用纤维素酶将纤维素降解为简单糖，进而发酵生产纤维素乙醇，成为可再生的绿色能源，是当前新能源开发的一个重要途径。由于酶解法分解后的产物较易被回收与利用，且污染较低，纤维素的酶解也就成了目前公认的较为理想的转化方法。而在纤维素乙醇的研发和未来的生产应用中，纤维素酶的成本居高是其将来大规模生产和应用的一大难题。因此，获得高活性和高稳定性的纤维素酶，成为低成本的纤维素乙醇生产中的关键因素。为寻找高活性和高稳定性的纤维素酶，科学家们已对自然界不同来源的物种中作了广泛地筛选，并对已获得的纤维素酶的活性和酶学性质进行了深入的研究。而开发纤维素酶的资源，以获得高活性和特殊酶学性质的纤维素酶，为将来纤维素酶的蛋白质结构分析和改造增加更多的数据，也是纤维素乙醇研发中的一个重要的研究方向。由于动物源纤维素酶系具有一定的独特性和高活性，成为优良性质的天然纤维素酶系筛选的资源。故而，本研究选择了昆虫中食用植物纤维的竹虫为材料，对其所含纤维素酶进行了分离纯化及酶学性质的研究。竹虫其幼虫主要寄生于巨竹体内，以富含纤维素的植物性物质为食，利用体内的酶使得纤维素成为其营养来源。由于其消化道不同于草食动物，水解纤维素的酶类可能与瘤胃微生物有所不同。通过获取和分析此类动物来源的纤维素酶，以期发现一些新特性的纤维素酶，为以后利用生物技术获得高性能纤维素酶提供重要基因来源。本文以竹虫为材料，经柠檬酸缓冲液匀浆抽提处理后，获得粗酶制剂。通过福林蛋白沉淀反应进一步制备纤维素酶系的活性测试用酶液。利用DNS显色法，扣除对应的分光空白和酶空白，在不同酶浓度梯度下测定了竹虫纤维素酶系的活性及其最适作用条件，此外探讨了金属离子对其纤维素酶系的影响。结果显示滤纸纤维素酶活性为FPU=0.5438U/ml，底物法活性测定结果为外切-β-1,4-葡聚糖苷酶的底物微晶纤维素的降解活性CB=0.4296U/ml，内切-β-1,4-葡聚糖苷酶的底物羧甲基纤维素钠的降解活性CMC=0.3657U/ml，β-葡萄糖苷酶的底物水杨素的降解活性SA=0.5285U/ml。此外确定了竹虫体内纤维素酶系FPU的最适pH为10.6，温度为50℃，反应时间为60min；CB的最适pH为7.0，温度为70℃，反应时间为60min；CMC的最适pH为9.4，温度为30℃，反应时间为40min；SA的最适pH为8.2，温度为50℃，反应时间为20min。这对于筛选天然的优良性质的纤维素酶系提供了参考。为了得到竹虫纤维素酶系的活性促进因子，进行了金属离子对竹虫纤维素酶系活性影响的实验。通过金属离子对竹虫纤维素酶系的影响可以看出大多数的金属离子都对竹虫体内纤维素酶系组分的活性起到抑制作用，特别是高的金属离子浓度比低浓度下抑制效果明显，主要表现在Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+表现出对FPU和SA的抑制，而对CB和CMC在低浓度下的促进和高浓度的抑制。Ag+、Mn2+、Fe2+由于对DNS显色反应有一定的干扰表现出纤维素酶系组分活性的促进，其对竹虫纤维素酶系组分的影响仍需要进一步深入研究。通过实验发现竹虫的粗酶液经福林蛋白沉淀反应改进后的离子交换层析，可以消除竹虫粗酶液中还原性物质对活性测定的影响，这对其纤维素酶系组分的分离纯化有一定的好处。采用改进后的离子交换层析以及凝胶过滤层析等方法，成功地从竹虫体内分离纯化出了比活力为13.23U/mg的内切纤维素酶组分，测定该酶的分子量约为55.2kDa，纯化倍数为4.35，得率是19.4%。纯化的内切纤维素酶可进行蛋白质的N端测序，并设计兼并性引物进一步获取其编码序列，这可为竹虫内切纤维素酶的克隆表达提供前期基础研究数据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写表
• 1 前言
• 1.1 纤维素酶系的组成、来源及分子结构
• 1.1.1 纤维素酶系的组成及来源
• 1.1.2 纤维素酶系的分子结构
• 1.2 动物纤维素酶系的分离纯化
• 1.3 纤维素酶系的基因克隆及表达
• 1.3.1 微生物纤维素酶系的克隆及表达
• 1.3.2 动物纤维素酶系的克隆和表达
• 1.4 纤维素酶系的蛋白质工程及定向化改造
• 1.4.1 糖苷水解酶家族的蛋白质工程
• 1.4.2 生物信息学在纤维素酶研究中的应用
• 1.5 竹虫的生物学特性
• 1.6 本项研究的意义和目的
• 2 竹虫纤维素酶系的酶学性质
• 2.1 主要仪器设备及试验试剂
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 主要试验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 竹虫组织粗酶液的制备及 DNS 显色剂的配置
• 2.2.2 福林蛋白沉淀反应
• 2.2.3 稀释酶液的蛋白定量
• 2.2.4 葡萄糖标准曲线的建立
• 2.2.5 滤纸法（FPU）活性测定
• 2.2.6 底物法活性测定
• 2.2.7 纤维素酶活性的计算方法
• 2.2.8 竹虫体内纤维素酶系的最适作用条件
• 2.2.9 金属离子对竹虫体内纤维素酶系的影响
• 2.2.10 数据分析方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 福林蛋白沉淀反应的有效性
• 2.3.2 反应用纤维素酶液的蛋白定量
• 2.3.3 葡萄糖标准曲线的建立
• 2.3.4 滤纸法（FPU）活性测定
• 2.3.5 底物法活性测定
• 2.3.6 竹虫体内纤维素酶系的最适作用条件
• 2.3.7 金属离子对竹虫体内纤维素酶系的影响
• 2.4 讨论
• 2.4.1 动物体内纤维素酶系活性测定的方法
• 2.4.2 竹虫体内纤维素酶系的活性和最适作用条件
• 3 竹虫体内内切-β-1,4-葡聚糖苷酶的分离纯化
• 3.1 主要仪器设备及试验试剂
• 3.1.1 主要仪器设备
• 3.1.2 主要实验试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 竹虫组织粗酶液的制备及离心
• 3.2.2 离子交换层析
• 3.2.3 凝胶过滤层析
• 3.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.2.5 葡萄糖标准曲线的绘制
• 3.2.6 洗脱样品的内切纤维素酶活性测定
• 3.2.7 洗脱样品中还原糖含量的测定
• 3.2.8 内切纤维素酶蛋白含量的测定
• 3.2.9 内切纤维素酶分子量的标定
• 3.3 结果
• 3.3.1 离子交换层析
• 3.3.2 离子交换层析的内切酶活性测定
• 3.3.3 改进后的离子交换层析
• 3.3.4 改进后的离子交换层析的内切酶活性测定
• 3.3.5 凝胶过滤层析
• 3.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.4 讨论
• 3.4.1 福林蛋白沉淀反应对内切纤维素酶分离纯化的影响
• 3.4.2 竹虫体内纤维素酶系组分的分离纯化
• 4 全文总结及进一步可以开展的工作
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 发表论文
• 参与科研项目
• 致谢
• 图版