神农宫扁角菌蚊Chetoneura shennonggongensis生物学、生态学及分子进化研究

论文摘要

洞穴昆虫对洞穴适应的特征表现为体色透明、视觉退化、感觉敏锐及代谢率低、发育历期长，是研究进化、动物地理的理想材料。神农宫扁角菌蚊Chetoneurashennonggongensis Amorim&Niu是首次报道的洞穴昆虫新种，属双翅目扁角菌蚊科，幼虫具有穴居、吐丝结网、捕食习性，但不发光。本文通过室内饲养和野外观察相结合的方法，研究了神农宫扁角菌蚊生物学特性，根据其形态学及生物学，明确了该昆虫的分类地位。通过野外系统调查，研究了神农宫扁角菌蚊幼虫种群的空间分布，揭示了其在洞穴食物网中的地位及影响幼虫种群分布的关键环境因子。此外，采用16S rDNA序列作为分子标记，构建了洞穴扁角菌蚊13个种及其地理种群的系统发育树，探索了扁角菌蚊科昆虫的分子进化及亲缘关系；利用巢式-PCR技术检测发现神农宫扁角菌蚊体内存在荧光酶基因的同源片段，并同澳大利亚发光的扁角菌蚊、果蝇及萤火虫的荧光酶基因进行了同源性比较，主要结论如下：1)新种的形态学特征神农宫扁角菌蚊成虫具有的触角扁平的鞭节、两单眼的存在、退化的口器、胸部前上侧片具刚毛、侧背片无刚毛、第4径脉（R4）和第5径脉（R5）愈合(R4+5)等形态特征，是扁角菌蚊科Chetoneura属共有的特征，而神农宫扁角菌蚊成虫后胸背板上无粗壮的刚毛，中脉M1与M2愈合(M1+2)，并与径分脉Rs有少量愈合，雄虫生殖刺突的端部没有刺，又是区别于该属其它种的特征。2)生物学特性神农宫扁角菌蚊一年发生一代。幼虫期较长，一般8-10个月，低龄幼虫存活率较低。幼虫栖居在黑暗潮湿的洞穴顶部，通过唾腺分泌大量垂直串珠状粘滞丝线，以捕食猎物。幼虫是唯一要取食的阶段，可以取食任何落入粘性丝网中的猎物，但优先捕食活的猎物或刚死的新鲜猎物。幼虫具有同类相食的现象。6月幼虫陆续化蛹，7月达到化蛹高峰期。幼虫化蛹后，蛹通过粘性的丝线悬挂，有垂直悬挂和水平悬挂两种方式。蛹历期短，一般6-7天，两性区别明显。成虫期短，雌虫较大，一般存活3-5天，雄虫细长，可存活5-7天。成虫口器退化、不取食，雌雄成虫一经相遇即可交配。雄虫可多次交配，雌虫只交配一次，交配后即可产卵。每只雌成虫平均产卵85枚。卵期约20-30天。3)生态学特性神农宫扁角菌蚊幼虫种群在洞穴中呈现典型的空间聚集分布，影响幼虫种群大小与分布的关键控制因子是相对湿度和洞穴水流pH值。此外，天敌洞穴盲蛛的捕食、真菌寄生以及人类活动的干扰也对幼虫种群的分布有重要影响。通过对神农宫洞穴动物的系统调查，建立了洞穴食物网，表明神农宫扁角菌蚊属于食物网中的中等消费者，主要以飞行性小型无脊椎动物为食，在野外也有同类相食的现象。4)分子进化研究将自测的扁角菌蚊科Chetoneura属3个种与从GenBank中下载的19条洞穴扁角菌蚊昆虫的16S rDNA基因片段进行了同源性比较，并以双翅目蕈蚊科假伊蕈蚊Pseudobrazypeza sp．和蚊科致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus作为复合外群，利用NJ法、MP法和ME法构建了分子系统树。在所获得的400bp序列中，有103个变异位点，86个简约信息位点；A、T、C和G碱基的平均含量分别为40．4％、40．0％、12．8％和6．8％，在碱基组成上具有A+T含量偏向性；在组成的20种氨基酸中，具有苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、赖氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）等含量偏向性。分子系统树分析结果表明，所研究的内群聚为5个大的聚类簇，即澳大利亚Campara亚群、Arachnocampa亚群、新西兰A．luminosa类群、北美Orfelia类群和中国Chetoneura类群，其中中国Chetoneura类群与北美Orfelia类群关系较近。5)荧光酶基因同源序列的检测获得的717bp的荧光酶基因同源片段，共编码218个氨基酸，在氨基酸组成上具有亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）和丙氨酸（Ala）偏好性，疏水氨基酸含量较高。其氨基酸序列与A．flava荧光酶基因氨基酸序列同源性为20．7％，低于果蝇Drosophila melanogaster与A．flava的同源性21．5％，而高于萤火虫Photinus pyralis与A．flava的同源性19．2％。与A．luminosa氨基酸同源性为21．0％，与A.richardse的同源性为21．3％，都高于D．melanogaster（20．4％，18．1％）和P．pyralis（19．2％，17．8％）与A．luminosa和A．richardse的同源性。神农宫扁角菌蚊具有荧光酶基因同源序列但不发光，表明荧光酶基因在进化过程中未表达或表达后没有活性，或者具有其他生理功能。本文选择神农宫扁角菌蚊这一独特的材料，通过生物学、生态学及分子进化研究，揭示了神农宫扁角菌蚊的系统发育关系，为扁角菌蚊科昆虫的进化提供了科学依据，并促进中国洞穴昆虫的深入研究和多样性保护。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 洞穴及洞穴环境概况
• 2 洞穴动物概况
• 2.1 洞穴动物的分类
• 2.2 洞穴动物研究概况
• 2.3 洞穴昆虫研究概况
• 3 扁角菌蚊科昆虫研究概况
• 3.1 分类地位及定名
• 3.2 栖息环境
• 3.3 捕食行为
• 3.4 发光行为及发光机制
• 3.5 扁角菌蚊科昆虫的进化
• 4 本研究的目的和意义
• 4.1 进化上的意义
• 4.2 洞穴生物多样性保护
• 5 研究内容
• 5.1 生物学方面
• 5.2 生态学特性
• 5.3 分子系统发育
• 5.4 荧光酶基因的巢式PCR检测
• 6 技术路线
• 7 本研究的创新点
• 第二章 神农宫扁角菌蚊Chetoneura shennonggongensis生物学特性研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 标本的采集
• 2.1.2 幼虫饲养材料
• 2.1.3 主要仪器和设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 幼虫的饲养
• 2.2.2 生活史的调查
• 2.2.3 基本形态描述
• 2.2.4 行为的观察
• 3 结果与分析
• 3.1 卵
• 3.2 幼虫
• 3.2.1 幼虫形态
• 3.2.2 幼虫的吐丝建巢行为
• 3.2.3 幼虫的捕食行为
• 3.2.4 幼虫同类相食的现象
• 3.3 蛹
• 3.4 成虫
• 3.4.1 羽化
• 3.4.2 成虫形态特征
• 3.4.3 交配
• 3.4.4 产卵
• 4 讨论
• 4.1 卵
• 4.2 幼虫
• 4.2.1 幼虫的吐丝行为
• 4.2.2 幼虫的捕食特性
• 4.2.3 幼虫同类相食的习性
• 4.3 蛹
• 4.4 成虫
• 4.4.1 成虫特性
• 4.4.2 交配
• 第三章 神农富扁角菌蚊Chetoneura shennonggongensis的生态学研究
• 1 环境概况
• 2 材料与方法
• 2.1 供试昆虫
• 2.2 实验材料
• 2.3 调查方法
• 2.3.1 神农宫扁角菌蚊幼虫种群分布的调查
• 2.3.2 洞穴生物食物网的调查
• 2.4 分析方法
• 2.4.1 幼虫种群空间分布
• 2.4.2 环境因子相关性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 幼虫种群的空间分布
• 3.1.1 扩散系数法结果分析
• 3.1.2 K值法分析结果
• 3.1.3 平均拥挤度判断法
• 3.1.4 回归分析结果
• 3.2 半方差函数与空间分布
• 3.3 神农宫部分环境因子季节动态
• 3.3.1 神农宫洞穴四季环境指标
• 3.3.2 神农宫各区域温度季节动态
• 3.3.3 神农富各区域相对湿度度季节动态
• 3.3.4 幼虫数量季节动态
• 3.4 幼虫数量与环境因子的相关性分析结果
• 3.5 神农宫扁角菌蚊所处洞穴食物网中的地位
• 3.5.1 神农宫洞穴动物组成及分析
• 3.5.2 洞穴生物食物网
• 4 讨论
• 4.1 调查方法的讨论
• 4.2 幼虫种群在空间呈现聚集分布状态
• 4.2.1 聚集度指标法分析
• *=α+βx回归分析'>4.2.2 Iwao M^*=α+βx回归分析
• 4.2.3 半方差函数分析
• 4.3 控制种群分布的关键因子
• 4.3.1 物理因子
• 4.3.2 生物因子
• 第四章 基于16S rDNA基因的洞穴扁角菌蚊科部分类群的系统发育研究
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器和设备
• 1.2 主要试剂及试剂的配制
• 1.3 供试昆虫
• 1.4 供试菌株
• 1.5 实验方法
• 1.5.1 基因组DNA的提取
• 1.5.2 基因组DNA的检测
• 1.5.3 16SrDNA的PeR扩增
• 1.5.4 PCR产物的回收
• 1.5.5 感受态细胞的制备
• 1.5.6 目的片段与载体的连接
• 1.5.7 大肠杆菌转化
• 1.5.8 数据处理与分析
• 1.5.9 系统发育分析
• 2 结果与分析
• 2.1 基因组DNA提取与质量检测
• 2.2 16S rDNA基因PCR扩增结果
• 2.3 16S rDNA重组克隆质粒的菌落PCR结果
• 2.5 目的基因的序列分析
• 2.6 密码子的使用频率与氨基酸组成分析
• 2.7 碱基颠换分析
• 2.8 聚类分析结果
• 3 讨论
• 3.1 外群的选择
• 3.2 构建分子系统树的方法
• 3.3 所研究类群16S rDNA基因部分片段的序列组成及分析
• 3.4 系统发育
• 3.5 进化顺序
• 第五章 神农宫扁角菌蚊Chetoneura shennonggongensis荧光酶基因同源序列的PCR检测
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器和设备
• 1.2 主要试剂及配制
• 1.3 供试昆虫
• 1.4 供试菌株
• 1.5 实验方法
• 1.5.1 总RNA的提取
• 1.5.2 总RNA的检测
• 1.5.3 荧光酶基因的巢式PCR检测
• 1.5.4 cDNA第一链的合成
• 1.5.5 巢式PCR第一轮扩增
• 1.5.6 巢式PCR第二轮扩增
• 1.5.7 扩增产物的回收、克隆与测序
• 1.5.8 数据处理与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA提取结果
• 2.2 目的基因巢式PCR扩增结果
• 2.3 目的基因重组克隆质粒的菌落PCR结果
• 2.4 目的基因的序列测定
• 2.5 目的基因序列分析
• 2.6 同源性分析
• 3 讨论
• 3.1 实验的影响因子
• 3.2 神农宫扁角菌蚊荧光酶基因同源序列组成分析
• 第六章 总结与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 硕士期间参与的主要活动及会议
• 硕士期间发表的文章