论文摘要
戊型肝炎是由戊型肝炎病毒引起的一种急性、自限性人畜共患传染病,该病主要经粪—口途径传播,临床病变以黄疸为主。主要暴发于发展中国家。继1988-1989年我国新疆暴发戊型肝炎后,该病在我国开始散在分布。1997年,美国学者Meng等首次在猪血清中分离到戊型肝炎病毒,随后在其他各国也相继报道了猪的戊型肝炎病毒,主要是HEV基因Ⅲ型和Ⅳ型,在我国养猪业以基因型Ⅳ型为主。本实验室检测并分离到的戊型肝炎病毒从属于基因Ⅳ型,相关报道显示,人所感染的戊型肝炎病毒的基因序列与猪的戊型肝炎病毒的基因序列相比,基因Ⅳ型的同源性最高。由于缺乏有效的体外培养系统,对戊型肝炎病毒的复制及其转录机制的研究进展相当缓慢。为了打破这一瓶颈,panda等在2000年引入了感染性克隆技术。鉴于以上基础,本实验对在华中地区戊型肝炎阳性病料中的病毒进行了感染性克隆以及复制子的研究,主要内容包括：（1）戊型肝炎病毒感染性克隆质粒的构建在已经测通的WH09株HEV的全基因组序列的基础上,将HEV的全长分割成5个片段分别设计引物进行克隆,测序,序列比对正确后将其按照全长基因组的顺序依次连在pCDNA3.1载体上,得到了含有戊型肝炎病毒全基因组的重组质粒。（2）戊型肝炎病毒感染性克隆质粒恢复病毒活性的验证将质粒在末端（载体上）线性化,纯化后转染肝癌细胞PLC/PRF/5,进一步通过RT-PCR方法检测到戊型肝炎病毒能够在细胞中复制三代,且随着复制代数增加其活性也会逐渐消失,通过IFA的方法能够检测到病毒蛋白的表达。（3）戊型肝炎病毒的复制子质粒的构建与复制能力的恢复验证在戊型肝炎病毒的全基因组中缺失掉部分结构基因,插入易于检测的外源基因,构建了分别含有外源基因IRES-EGFP、IRES-Luc的复制子,进行验证,含有IRES-EGFP的复制子没能找到发光的细胞,结果显示含有IRES-Luc的复制子经过双荧光素酶的检测能够检测到Luc的表达,对缺失掉ORF1部分的缺失体进行验证发现几乎检测不到Luc的表达,从而证实了Luc的表达依赖复制子本身的自复制能力。（4）复制子细胞系的构建将证实能够表达的复制子HEV-IRES-Luc构建细胞系,使其能够稳定表达,为今后的研究建立平台。