甘蔗花叶病病毒蛋白基因（SrMV-HC-Pro）的遗传转化甘蔗研究

论文摘要

甘蔗花叶病（Sugarcane Mosaic Disease）是一种严重危害甘蔗生长的病毒性病害。病发时造成甘蔗大量减产、品质下降。经甘蔗花叶病毒株系的分子鉴定,我国糖蔗主要感染高粱花叶病毒（SrMV）,该病毒是马铃薯Y病毒属的一员。利用生物信息学软件对HC-Pro蛋白进行分析,认为HC-Pro是一个稳定蛋白,可能存在多个疏水区,但疏水性不强,不存在跨膜区;二级结构预测分析该蛋白结构和功能域,结果表明HC-Pro蛋白可能含有很多螺旋结构。本研究通过基因枪（PDS-1000He）轰击法将构建好的SrMV-HC-Pro基因的植物表达载体UBI-SrMV-HC-Pro与带pmi筛选标记基因的pZMLR14植物表达载体共转化导入甘蔗品种福农95-1702的胚性愈伤组织中,共轰击了1500个甘蔗愈伤组织块,在含有甘露糖的选择培养基上进行抗性筛选,经继代、分化、促根,获得抗性转化甘蔗幼苗55株。通过氯酚红显色法对55个植株进行pmi标记基因的检测鉴定,共发现26株显色。经PCR检测,获得阳性植株12株;对阳性植株进一步进行RT-PCR和点杂交鉴定,最终获得10株转基因植株:但检测到的10株转目的基因植株中只有9株显色,说明有一株转基因植株没有pmi标记基因的整合。对转化所得的10株转基因植株进行调查,发现其全部发病,说明HC-Pro基因可能是甘蔗花叶病发病的关键基因。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 甘蔗花叶病
• 1.1.1 甘蔗花叶病的危害
• 1.1.2 高粱花叶病毒
• 1.1.3 甘蔗花叶病的传播及防治
• 1.2 马铃薯Y病毒属病毒的研究背景和现状
• 1.2.1 马铃薯Y病毒的结构
• 1.2.2 马铃薯Y病毒属病毒的功能
• 1.2.3 马铃薯Y病毒病的传播
• 1.3 植物抗花叶病病毒基因工程研究
• 1.4 HC-Pro基因的研究进展
• 1.4.1 HC-Pro的来源
• 1.4.2 HC-Pro的结构及蚜传机制
• 1.5 本项目研究的意义、研究方法与技术路线
• 1.5.1 研究意义
• 1.5.2 研究内容与技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 甘蔗材料
• 2.1.2 试剂和工具酶
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 分子生物学研究方法
• 2.2.1 引物
• 2.2.2 质粒pZMLR14少量提取及纯化
• 2.2.3 HC-Pro基因片段PCR扩增及回收
• 2.2.4 重组载体构建
• 2.3 基因枪（PDS-1000He）轰击转化甘蔗
• 2.4 转HC-Pro基因植株的分子鉴定
• 2.4.1 氯酚红显色法鉴定pmi基因
• 2.4.2 转HC-Pro基因植株PCR分析鉴定
• 2.4.3 PCR检测阳性植株叶片总RNA RT-PCR分析鉴定
• 2.4.4 RT-PCR检测阳性植株基因组DNA的点杂交分析鉴定
• 3 结果和分析
• 3.1 HC-Pro蛋白的生物信息学分析
• 3.2 含SrMV-HcPro基因的植物表达载体构建策略
• 3.3 转基因植株的分子验证
• 3.4 转基因植株的遗传转化率
• 3.5 转基因植株的发病情况调查
• 4 讨论
• 4.1 基因枪介导的共转化效率
• 4.2 pmi/甘露糖筛选体系的选择
• 4.3 HC-Pro基因的致病作用
• 5 小结
• 5.1 主要结论
• 5.2 本研究的主要创新点
• 5.3 进一步的研究工作计划及展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢