Pkhd1缺失与肾集合管上皮细胞凋亡及ARPKD囊肿形成的机制研究

论文摘要

研究背景常染色体隐性多囊肾（Autosomal recessive polycystic kidney disease, ARPKD）是一种多发于婴幼儿的遗传性疾病,全球发病率约为1:20000,其主要临床症状为双肾集合管和肝胆管扩张伴肝肾纤维化,约50%患者在胎儿期已经发病,出生时伴随因60-90%集合管扩张引起的双肾梭形囊肿,这些患者常在婴儿期即由于呼吸和肾功能障碍而死亡,死亡率约为30%。ARPKD的主要致病基因是Pkhd1,该基因定位于人染色体6p21.1-12,编码一个由4074个氨基酸组成的单跨膜受体样蛋白Fibrocystin（FPC）。FPC定位于肾上皮细胞的初级纤毛和基体内。多囊肾的发生很可能由人类肾脏小管生长发育分子失调所造成,因此揭示多囊肾发病机制,将有助于揭示肾脏小管发生、发育的分子机制。目前,我们已通过基因打靶技术建立Pkhd1基因第15和16号外显子敲除小鼠模型,由于Pkhd1基因缺失,该小鼠模型的肝和肾表现出不同程度的管道扩张、囊肿和纤维化;另外,Pkhd1缺失小鼠的胰腺和脑组织也出现囊肿和小管扩张;这些症状很好地模拟了人类ARPKD。为阐明Pkhd1基因缺失在ARPKD发生发展中的作用及其相关机制,本课题拟利用我们新建立的Pkhd1基因敲除模型和肾集合管上皮细胞株,观察FPC缺失对肾集合管上皮细胞增殖和凋亡的影响,并研究其可能存在的相关机制,为探索ARPKD的发病机制和今后靶向治疗提供新思路。第一部分ARPKD致病基因Pkhd1细胞生物学基本功能的研究目的:利用我们新建立的Pkhd1基因敲除模型和肾集合管上皮细胞株,观察FPC缺失对肾集合管上皮细胞生物学的影响。方法:1.将Pkhd1杂合子小鼠（Pkhd1+/-）与Immorto （Im）小鼠交配产生Im::Pkhd1-/-小鼠和同窝Im::WT野生型小鼠。从8周龄Im::Pkhd1-/-小鼠和同窝Im::WT小鼠中取出肾脏,应用Dolichus biflorus agglutinin （DBA）分离方法,获得永生化肾集合管上皮细胞系。利用免疫荧光染色法,检测永生化肾集合管细胞DBA（集合管细胞标志物）、E-cadherin和Cytokeratin（上皮细胞标准物）的表达情况,鉴定细胞原始来源。施用PCR、实时定量PCR、RT-PCR和Western blot方法,分别从DNA、RNA及蛋白水平鉴定Pkhd1野生型和纯合型细胞Pkhd1表达情况。2.应用胶原/基质胶三维（3D）培养法,观察FPC缺失肾集合管上皮细胞形成管状分支结构状况。3.用ZO-1和E-cadherin抗体进行免疫荧光染色和Western blot方法,检测FPC缺失是否破坏肾集合管上皮细胞紧密连接和间隙连接。4.通过EVOM/STX2电阻测量仪测定细胞跨膜电阻抗（TER）,观测FPC缺失对细胞紧密连接的影响。5.使用罗丹明-鬼笔环肽抗体对细胞F-actin进行免疫荧光染色,观察FPC缺失后肾集合管上皮细胞中F-actin形态和分布的改变。6.应用细胞粘附和细胞穿膜实验,检测FPC缺失是否影响细胞-胞外基质间的相互作用。7.用Acetylated-α-tubulin抗体进行免疫荧光染色,并利用Zeiss LSM成像系统进行多层扫描叠加,以观察FPC缺失对细胞纤毛结构和数量的影响。8.采用3H（氚）-TdR掺入法,检测肾集合管上皮细胞的增殖效应。9.应用磷酸化组蛋白H3和PCNA抗体分别进行免疫荧光染色、免疫组织化学染色和Western blot,从体内、外检测肾上皮细胞增殖情况。10.利用末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）和Caspase-3免疫荧光染色法（或免疫组织化学）,分别从体内、外观察肾上皮细胞凋亡。结果:1.应用Dolichus biflorus agglutinin （DBA）分离方法,从8周龄Im::Pkhd1-/-小鼠和同窝Im::WT小鼠肾脏中,获得38个Im::Pkhd1-/-和Im::WT永生化肾集合管细胞系;随后,用DBA、E-cadherin和Cytokeratin鉴定细胞原始来源,最终获得26个Im::Pkhd1-/-纯合型和21个Im::WT野生型来源于肾脏集合管的细胞克隆。我们随机选取四株细胞W10B6、W10B2（Im::WT）和M10H2、M10C7(Im::Pkhd1-/-)用于进一步实验研究;应用PCR鉴定各株细胞基因型,结果显示,野生型为270bp,Pkhd1-/-为380bp;同时,通过实时定量PCR和RT-PCR证实野生型细胞株表达Pkhd1,而Pkhd1-/-细胞株不表达Pkhd1;利用我们实验室前期制备的FPC单克隆抗体hAR-C2m4E12进行Western blot检测,结果显示,Pkhd1-/-细胞株没有FPC的表达,而只有野生型细胞表达FPC。2.在胶原/基质胶三维（3D）培养条件下野生型肾集合管上皮细胞（W10B6、W10B2）约60%的细胞能形成4个及其以上的分支,约40%的细胞能形成1-3个分支,仅极少数（不足5%）细胞不能形成分支结构;而纯合型细胞（M10H2、M10C7）约95%的细胞不能建立管状分支结构,形成肾囊样结构,并具有细胞聚集性,约5%的细胞能形成1-3个分支管状结构,仅不足2%的细胞形成4个以上的分支结构。3.用ZO-1抗体进行免疫荧光染色,发现野生型（W10B6、W10B2）细胞具有整齐而规则的紧密连接,而纯合型（M10H2、M10C7）细胞连接呈不规则弯曲形状,并且许多细胞间紧密连接不完整;用E-cadherin抗体进行免疫荧光染色,结果显示,野生型（W10B6、W10B2）细胞E-cadherin主要分布在细胞-细胞连接处,而纯合型（M10H2、M10C7）细胞E-cadherin在细胞连接处分布不连续,且在胞浆内呈大量弥散分布;然而,Western blot检测两者细胞中ZO-1和E-cadherin蛋白表达均无显著性差异。4.利用EVOM/STX2电阻仪测量细胞跨膜电阻情况,结果表明,野生型（W10B6、W10B2）细胞从第4天开始跨膜电阻明显升高,表明此时细胞已经建立了紧密连接,并能持续至第7天;而纯合型（M10H2、M10C7）细胞跨膜电阻增加缓慢,且在第7天时开始出现下降趋势。5.用罗丹明-鬼笔环肽抗体对细胞F-actin进行免疫荧光染色,100倍显微镜下结果显示,野生型（W10B6、W10B2）细胞F-actin具有整齐而均一的应力纤维,主要分布在细胞-细胞连接处,而纯合型（M10H2、M10C7）细胞F-actin分布有纤细而不规则弯曲的应力纤维,并且细胞间连接不完整;激光共聚焦观察野生型（W10B6、W10B2）细胞F-actin主要分布在细胞周边和核周围,分布均匀、排列整齐紧密,细胞间连接紧密,没有间隙形成,在细胞与细胞接触处呈束状相互连接,形成周边肌动蛋白丝带,而纯合型（M10H2、M10C7）细胞F-actin排列紊乱,变短,变细,应力纤维断裂,形成细胞间隙。在胶原/基质胶三维（3D）培养下观察F-actin分布,野生型（W10B6、W10B2）细胞在细胞周边和核周围可形成丰富均一的应力纤维,而纯合型（M10H2、M10C7）细胞在三维状态下仅有少量、单一的应力纤维。6.细胞粘附实验结果发现,当胶原浓度达到0.125μg/ml时,约40%的野生型（W10B6、W10B2）细胞粘附于细胞培养板,而仅15%的纯合型（M10H2、M10C7）细胞粘附于培养板,随着胶原浓度增高,野生型（W10B6、W10B2）细胞粘附进一步增强,纯合型（M10H2、M10C7）细胞并没有显著升高;细胞穿膜实验显示,纯合型（M10H2、M10C7）细胞迁移能力显著低于野生型（W10B6、W10B2）细胞。7.用Acetylated-α-tubulin抗体进行免疫荧光染色,激光共聚焦观察,约80%的野生型（W10B6、W10B2）细胞具有纤毛结构,而约30%的纯合型（M10H2、M10C7）细胞具有纤毛结构。同时,将染色细胞进行多层扫描叠加后,测量纤毛长度发现,野生型（W10B6、W10B2）细胞纤毛长度平均超过2.5μm,而纯合型（M10H2、M10C7）细胞纤毛长度平均不足1.5μm。8. 3H（氚）-TdR掺入法结果显示,与野生型（W10B6 and W10B2）细胞相比,Pkhd1-/- （M10H2、M10C7）细胞摄入3H的能力明显下降,提示Pkhd1缺失抑制细胞增殖。9.施用磷酸化组蛋白H3染色法,发现纯合型（M10H2、M10C7）细胞有丝分裂期细胞数明显减少（*P<0.05）。利用Western blot检测磷酸化组蛋白H3和PCNA在野生型（W10B6、W10B2）和纯合型（M10H2、M10C7）细胞中的表达,结果显示,纯合型（M10H2、M10C7）细胞中磷酸化组蛋白H3和PCNA蛋白表达水平显著低于野生型（W10B6、W10B2）细胞。应用免疫组织化学和免疫荧光染色,分别检测了Pkhd1-/-和野生型小鼠6周,3个月,6个月肾组织中PCNA和磷酸化组蛋白H3蛋白表达情况。结果表明, Pkhd1-/-小鼠中肾上皮细胞PCNA阳性细胞较野生型小鼠明显减少;磷酸化组蛋白H3染色也得到相似结果。10.在常规培养条件下,细胞经过Ionomycin诱导凋亡后,采用末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法和Caspase-3活化标记检测Pkhd1野生型和纯合型细胞凋亡情况,发现纯合型细胞凋亡率为14%,显著多于野生型细胞凋亡率（5%）。为了证实体外实验结果,采用免疫组织化学和免疫荧光染色,在Pkhd1-/-和野生型小鼠3个月,6个月,12个月肾组织中检测Caspase-3蛋白表达情况,发现Pkhd1缺失小鼠中Caspase-3活化细胞明显多于野生型小鼠。TUNEL染色检测结果证实,12个月大的Pkhd1缺失小鼠中阳性染色细胞显著高于野生型小鼠,同时,在Pkhd1缺失小鼠的肾小管中可见许多凋亡碎片。结论:1.成功建立Pkhd1野生型和纯合型小鼠肾脏集合管上皮细胞。2. Pkhd1为肾集合管细胞在3D培养条件下管状分支结构形成所必须。3. FPC缺失可导致肾集合管细胞-细胞连接、细胞-胞外基质黏附异常。4. FPC缺失能导致肾集合管纤毛结构和细胞骨架异常。5. FPC缺失可抑制肾集合管细胞增殖,促进细胞凋亡。第二部分细胞凋亡信号通路在Pkhd1缺失的肾集合管细胞中的作用目的:探讨Pkhd1缺失抑制细胞增殖,促进细胞凋亡导致ARPKD囊肿形成的分子机制。方法:1. Western blot检测磷酸化Akt改变对Pkhd1纯合型细胞凋亡信号通路的影响。2. Western blot检测Pkhd1纯合型细胞中Ras-Raf-MEK-ERK信号通路的改变。3. Western blot检测FPC缺失对细胞增殖和凋亡FAK磷酸化位点的影响。4. Western blot检测Pkhd1纯合型细胞中Akt上游信号通路PI3K-PDK1的改变。结果:1. Western blot结果显示,经CI诱导后,Pkhd1纯合型（M10H2、M10C7）细胞中磷酸化Akt（Ser473）活性较野生型（W10B6、W10B2）细胞明显下降,而Pkhd1纯合型细胞Bax、Caspase-9和Caspase-3表达均明显高于野生型细胞。2. Western blot结果表明,经CI诱导10,30,60分钟后,磷酸化c-Raf、Pan-Ras、磷酸化MEK和磷酸化ERK在Pkhd1纯合型（M10H2、M10C7）细胞中明显下降,而B-Raf表达与野生型细胞相比差异没有显著性意义。3. Western blot结果显示,经CI不同时间点诱导的纯合型（M10H2、M10C7）细胞与野生型（W10B6、W10B2）细胞相比较, FAK pY 861,397, 576和925均明显下降。4.我们首先应用PI3K classⅢ和PI3K p110α抗体进行分析,结果发现PI3K classⅢ在纯合型（M10H2、M10C7）和野生型（W10B6、W10B2）细胞中差异没有显著性意义。相反,PI3K p110α在正常培养和经CI诱导的纯合型中比野生型细胞显著下降。进而,我们分析了PDK1在纯合型和野生型细胞中磷酸化改变情况,与PI3Kp110α结果相似,PDK1p241磷酸化水平在正常培养和CI诱导的纯合型细胞中明显低于野生型细胞。结论:1. FAK-PI3K-Akt-Caspase 3凋亡信号通路可能参与了Pkhd1缺失的肾集合管上皮细胞囊肿形成。2. FPC缺失可能经Ras-c-Raf-MEK-ERK信号通路抑制肾集合管上皮细胞增殖。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文缩略词索引
• 前言
• 第一部分 ARPKD 致病基因 Pkhd1 细胞生物学基本功能的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 细胞凋亡信号通路在Pkhd1缺失的肾集合管细胞中作用的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录一
• 附录二 主要试剂配制
• 附录三 攻读博士学位期间主要研究成果
• 致谢