拟南芥与草酸互作的分子机制研究

论文摘要

许多在生态、生理学上不同的真菌都可以产生草酸（Oxalic acid, OA）。这些草酸产生菌如核盘菌、灰葡萄孢等寄主范围广泛,可以引致上百种植物病害,造成世界范围的粮油、蔬菜等农作物的严重减产。草酸在病菌致病过程中可能起着关键性的作用。因此研究植物对草酸产生菌的防卫机制,挖掘抗病资源,提高农作物抗性,是急需解决的重要科学问题,也是生产上首先要解决的实践问题。拟南芥具有基因组小、结构简单、形体小、生长周期短、繁殖系数高、自花授粉、基因组序列已知、与高等植物的基因组间有较高同源性等特点,是研究植物防御机制的良好模式植物。因此本论文着眼于拟南芥与草酸的互作机制的研究。分为三部分:1.通过筛选草酸抗性突变体,并对突变体进行分子分析。最终目的是分离草酸抗性基因来获得作物的菌核病抗性,从而减少农药的使用,提高环境的质量和食品安全;2.草酸可以通过氧化与脱羧两条途径降解,本研究从枯草芽孢杆菌中克隆草酸脱羧酶,从大麦中克隆草酸氧化酶,构建其植物表达载体,转化拟南芥,对转基因植株进行菌核病抗性分析;3.对草酸胁迫下拟南芥全基因表达谱和microRNA的差异表达谱进行分析,进一步明了草酸致病的分子机制,为草酸产生菌的生物防治提供理论基础。获得的主要结果如下:1.通过拟南芥Col-0的浓度梯度的实验,确定了筛选草酸抗性突变体的筛选压为1.2mmol/L OA;建立并优化了草酸抗性突变体的筛选体系;2.通过对中国科学院遗传与发育生物学研究所左健儒实验室构建的化学诱导型功能获得和缺失性突变体库（公开释放的6,000余个突变体）进行两代的筛选,得到5株草酸抗性增强突变体,并通过TAIL-PCR扩增获得T-DNA插入的侧翼序列;BLAST结果显示这5株突变体中有4株突变体（D630、D282、D154、D74）均插在At5g10450的第一个内含子上,并且验证了At5g10450基因的SALK T-DNA插入缺失突变体的SALK068774（插入位点为外显子）的纯合体并没有草酸抗性。D33突变体插入位点为At2g39720和At2g39730两个基因间区;3.半定量RT-PCR表明D33突变体的At2g39690、At2g39700、At2g39720及At2g39750表达上调;4.构建了At2g39690,At2g39700和At2g39720的过表达载体,进行了拟南芥浸花转化,将对转基因植株进行菌核病抗性和草酸抗性分析;5.对突变体分别进行了核盘菌的离体叶片接种和活体接种,发现无论是离体接种还是活体接种,突变体都比野生型植株更抗菌核病。说明通过筛选草酸抗性突变体来筛选抗菌核的材料是可行的。有可能通过分离草酸抗性基因来获得作物的菌核病抗性,从而减少农药的使用,提高环境的质量和食品安全;6.从枯草芽孢杆菌Bs168中克隆了草酸脱羧酶基因（Yvrk）,从大麦中克隆了草酸氧化酶基因（Y14203）并构建了植物表达载体,对拟南芥进行转化,获得了转基因植株。转草酸脱羧酶的拟南芥植株表现出对核盘菌的抗性,这为草酸产生菌的生物防治提供了一条新途径;7.首次利用拟南芥全基因组Oligo芯片研究草酸胁迫下差异基因表达谱。通过对两张生物学重复的表达谱芯片数据的生物信息学分析表明:草酸胁迫诱导了拟南芥的JA/ET途径,而不是SA途径。此外,苯丙烷代谢途径、WRKY转录因子家族、细胞色素P450家族、ABC转运蛋白、热激蛋白基因家族上调表达,表明这些途径或基因家族参与了拟南芥对草酸的抗性反应。8.首次利用拟南芥microRNA芯片研究草酸胁迫下microRNA差异基因表达谱。获得三个差异表达microRNA和9个差异表达的PredictedmiRNA。其中下调表达的小立碗藓Ppt-miR1211,根据miRU找到一个最匹配的靶mRNA是一个萜烯合成酶（At3g14520）;另一下调表达的毛果杨Ptc-miR3991 （与Ath-miR399b同源）,对应的靶mRNA是一个泛素连接酶（At2g33770）;这两个靶基因在表达谱芯片中的Ratio值都上调。上调表达的Ath-miR858有三个靶mRNA,分别为At2g47460（转录因子）、At3g08500（转录因子）、At3g20310（ethylene responsive element- binding family protein）,它们在表达谱芯片中对应的Ratio值都分别下调。说明microRNA对其靶mRNA确有负调控功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文所用缩略词中英文对照
• 第一章 文献综述
• 1 草酸产生菌相关研究进展
• 1.1 草酸是草酸产生菌的普遍且关键的致病因子
• 1.2 草酸产生菌与植物的互作及信号转导
• 1.2.1 植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）
• 1.2.2 草酸产生菌的信号转导
• 1.3 草酸的两条主要降解途径及其研究进展
• 1.4 草酸可以用来筛选作物抗病突变体，研究作物的抗病机制
• 2 T-DNA 标签技术在植物功能基因组研究中的作用
• 2.1 农杆菌介导的T-DNA 插入
• 2.2 T-DNA 插入突变的几种方法
• 2.2.1 插入失活突变（LOSS OF FUNCTION）
• 2.2.2 激活标签（ACTIVATION TAGGING）
• 2.2.3 化学诱导表达标签（CHEMICAL INDUCIBLE GENE EXPRESSION TAG）
• 2.2.4 基因陷阱（GENE TRAP）
• 2.3 T-DNA 标签技术在植物功能基因组研究中的作用
• 2.3.1 T-DNA 插入片段侧翼序列的分离
• 2.3.2 T-DNA 标签技术在植物功能基因组研究中的作用
• 2.4 转座子标签
• 3 基因芯片在植物抗病机制研究上的应用
• 3.1 基因芯片概述
• 3.2 基因芯片在植物－病原物互作中的作用
• 3.3 MICRORNA 芯片在植物功能基因组学研究中的应用
• 3.3.1 MICRORNA 的生物合成与功能
• 3.3.2 MICRORNA 识别与鉴定
• 3.3.3 MICRORNA 研究展望
• 4 本课题的研究目的、研究意义及主要研究内容
• 第二章 拟南芥草酸不敏感突变体的筛选与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 拟南芥突变体库及病原菌菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 克隆载体,转化菌株及生化试剂
• 1.4 拟南芥的种植
• 1.5 突变体的筛选方法
• 1.6 草酸抗性增强突变体的分子分析
• 1.6.1 拟南芥基因组DNA 的提取
• 1.6.2 突变体T-DNA 插入侧翼序列的获得
• 1.6.3 RT-PCR 验证突变体T-DNA 插入位点上下游基因的表达情况
• 1.6.4 上调基因的过表达载体的构建
• 1.6.5 At5g10450 的SALK T-DNA 插入缺失突变体草酸抗性分析
• 1.7 草酸抗性增强突变体的简单遗传分析
• 1.7.1 突变体与野生型Col-4 的杂交及卡纳抗性分析
• 1.7.2 Npt II 的扩增
• 1.8 核盘菌的接种方法
• 1.8.1 核盘菌离体叶片接种法
• 1.8.2 核盘菌活体叶片接种法
• 2 结果与分析
• 2.1 草酸不敏感突变体筛选方法的建立
• 2.2 草酸不敏感突变体的筛选
• 2.3 草酸不敏感突变体的T-DNA 插入位点分析
• 2.4 D33 突变体的T-DNA 插入位点上下游基因的表达情况
• 2.5 过表达载体的构建
• 2.5.1 AT2G39690 过表达载体的构建
• 2.5.2 AT2G39700 过表达载体的构建
• 2.5.3 AT2G39720 过表达载体的构建
• 2.5.4 过表达载体BAR 基因的验证
• 2.5.5 拟南芥转基因阳性植株的获得
• 2.6 AT5G10450 基因的功能缺失突变体的草酸抗性分析
• 2.7 草酸抗性突变体的遗传分析
• 2.7.1 草酸抗性突变体的KM 抗性
• 2.7.2 NPT II 的扩增
• 2.8 草酸抗性突变体的菌核病抗性分析
• 3 讨论
• 3.1 草酸作为选择压力用于筛选抗性增强突变体是切实可行的
• 3.2 植物对草酸的抗性与对草酸产生菌的抗性相关
• 4 小结
• 第三章 草酸胁迫下拟南芥基因表达谱分析
• 1 材料与方法
• 1.1 拟南芥芯片与探针
• 1.2 拟南芥RNA 的提取、纯化与检测
• 1.3 样品RNA 的荧光标记（晶芯（?） cRNA 扩增标记试剂盒）
• 1.4 杂交清洗与芯片扫描
• 1.5 芯片图像的采集与数据分析
• 1.6 差异基因的生物信息学分析
• 1.7 差异基因的半定量RT－PCR 验证
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA 检测
• 2.2 芯片杂交结果
• 2.3 草酸胁迫下的拟南芥基因表达谱分析
• 2.3.1 JA 信号相关基因表达分析
• 2.3.2 乙烯信号相关基因表达分析
• 2.3.3 SA 信号相关基因表达分析
• 2.3.4 苯丙烷代谢途径相关基因表达分析
• 2.3.5 WRKY 转录因子家族的表达谱
• 2.3.6 细胞色素P450 家族的表达谱
• 2.3.7 其它基因（家族）在表达谱芯片的表达情况
• 2.3.8 半定量RT－PCR 验证
• 3 小结
• 第四章 草酸胁迫下拟南芥MICRORNA 表达谱分析
• 1 材料与方法
• 1.1 拟南芥miRNA 芯片与探针
• 1.2 拟南芥RNA 的提取、纯化与检测
• 1.3 miRNA 的分离
• 1.4 miRNA 样品的荧光标记
• 1.5 杂交、清洗与扫描
• 1.6 数据分析
• 1.7 差异基因的生物信息学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA 检测
• 2.2 芯片杂交结果
• 2.3 草酸胁迫下的拟南芥MIRNA 差异表达谱分析
• 第五章 草酸降解途径中两种关键酶的克隆与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种和质粒载体
• 1.1.2 植物实验材料
• 1.1.3 酶和化学试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 基因组DNA 的提取
• 1.2.2 枯草芽孢杆菌YVRK 的克隆及其植物表达载体的构建
• 1.2.3 大麦草酸氧化OXO 的克隆及其植物表达载体的构建
• 1.2.4 拟南芥的转化及转基因植株的筛选
• 1.2.5 YVRK 转基因植株的验证
• 1.2.6 抗性植株的核盘菌致病性分析
• 1.3 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 枯草芽孢杆菌YVRK 的克隆及其植物表达载体的构建
• 2.2 大麦OXO 的克隆及其植物表达载体的构建
• 2.3 转基因植株的获得及检测
• 2.4 转基因植株的菌核病抗性分析
• 2.5 讨论
• 全文结论和创新点
• REFERENCES（参考文献）
• 攻读博士期间参与的科研项目及发表文章
• 致谢