论文摘要
目的：观察电针刺激对BMSCs移植治疗脑出血大鼠Wnt信号通路中Wnt3a、β-catenin、CyclinD1在出血灶周围脑组织表达的影响,探讨电针刺激能否增强Wnt信号通路的激活,进而促进植入BMSCs的增殖、分化,明显改善神经功能缺失症状,提高BMSCs移植治疗脑出血的疗效。方法：将冷冻保存的BMSCs复苏、传代,待细胞生长至80%左右融合时换成预诱导液,24h后再换成无血清诱导液诱导6h,收集细胞,调整细胞浓度为2.5×107个/ml备用。通过脑立体定位仪向SD大鼠脑尾壳核注射胶原酶2μl和肝素1μl建立脑出血模型,术后2h,24h,48h分别进行神经功能缺损评分（NSS评分）,大于9分者入选实验组。实验动物分为3组：1.生理盐水组（Control组）：术后第3天注入生理盐水20μl；2.细胞移植组（BMSCs组）：术后第3天移植BMSCs20μl;3.细胞移植加电针刺激组（Ea BMSCs组）：术后第3天移植BMSCs20μl,2h后电针刺激百会穴和大椎穴,之后每天电针刺激1次。根据治疗时间不同各组再分为1d、3d、5d、7d、14d 5个亚组,在相应时间点进行NSS评分,然后处死大鼠取材。采用免疫组化SABC法观察Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1在脑组织的表达情况；RT-PCR半定量检测Wnt3a、β-cateni、Cyclin D1mRNA, Western-blotting检测β-catenin、Cyclin D1蛋白在不同组别各个时间点的表达情况。结果：1.各组NSS评分随着时间延长逐渐降低,Ea BMSCs组在3d、5d、7d、14d低于Control组,p＜0.05；BMSCs组5d低于Control组,p<0.05。2.免疫组化显示阳性Wnt3a表达位于神经细胞核、胞浆和神经纤维；RT-PCR半定量检测Wnt3amRNA表达情况：Ea BMSCs组3d、5d、7d、14d高于Control组,p＜0.05；Ea BMSCs组5d、7d高于BMSCs,p＜0.05；Ea BMSCs组Wnt3a mRNA1d组开始表达逐渐增加,至第3d达高峰,随后下降,在第7d表达再次出现峰值。3.免疫组化显示阳性β-catenin表达位于神经细胞浆、胞核。RT-PCR半定量检测β-catenin mRNA表达情况：Ea BMSCs组1d、3d、7d、14d高于Control组,p＜0.05；Ea BMSCs组1d、3d、7d高于BMSCs组,p＜0.05；BMSCs组5d高于Control组,p<0.05;Ea BMSCs组β-catenin mRNA表达先逐渐降低,在5d后表达开始增加,第7d时达到峰值后下降；BMSCs组在第5d出现表达高峰。β-catenin蛋白表达：Ea BMSCs组在各个时间点的表达均高于BMSCs组和Control组,p<0.05; BMSCs组在第1d、7d高于Control组,p＜0.05；Ea BMSCs组β-catenin蛋白表达在第3d出现首个表达高峰后逐渐降低,5d后开始增加,第7d再次出现峰值,随后表达降低；BMSCs组在第7d出现峰值。4.免疫组化显示阳性Cyclin D1表达位于神经细胞胞浆、胞核。RT-PCR半定量检测Cyclin D1 mRNA表达情况：Ea BMSCs组1d、5d、7d、14d高于Control组,p＜0.05；Ea BMSCs组1d高于BMSCs组,p＜0.05；BMSCs组7d组高于Control组,p＜0.05,Ea BMSCs组Cyclin D1 mRNA表达先逐渐降低,在3d后表达开始增加,7d达到峰值后下降；BMSCs组在第7d出现表达高峰。Cyclin D1蛋白表达：Ea BMSCs组3d、5d、7d、14d高于Control组比较,p＜0.05；Ea BMSCs组3d、5d、7d高于BMSCs组,p<0.05;BMSCs组7d、14d高于Control组,p＜0.05；Control组1d高于Ea BMSCs组和BMSCs组,p＜0.05；Ea BMSCs组和BMSCs组Cyclin D1蛋白表达在第3d达高峰后降低,5d后逐渐增加,第14d维持在一个较高的表达水平。结论：1.单纯BMSCs移植治疗,可上调ICH大鼠出血灶周围脑组织β-catenin、CyclinDl mRNA和蛋白表达,激活Wnt信号通路,促进植入BMSCs增殖分化,改善神经功能缺失症状。2.BMSCs移植结合电针刺激治疗,ICH大鼠出血灶周围脑组织Wnt3a、β-catenin、CyclinDl mRNA和β-catenin、CyclinD 1蛋白表达高于单纯BMSCs移植,更有效激活Wnt信号通路；促进植入BMSCs增殖分化；同时电针刺激可有效防止偏瘫侧肢体废用性萎缩,明显改善ICH大鼠神经功能缺失症状。
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