抗汉坦病毒单链抗体/Cκ/protamine截短体融合蛋白的基因构建、表达及功能研究

抗汉坦病毒单链抗体/Cκ/protamine截短体融合蛋白的基因构建、表达及功能研究

论文摘要

目的:肾综合征出血热(HFRS)是由汉坦病毒引起的一种严重危害人类健康的传染性疾病,一旦暴发有很高的病死率,目前尚无特效疗法。本研究构建了抗汉坦病毒(Hantavirus, HV)抗原的单链抗体和鱼精蛋白片段的重组基因,并在大肠杆菌中表达、纯化后,进行融合蛋白的功能活性鉴定,期望获得一种汉坦病毒特异性的靶向核酸运输载体。方法:采用重组PCR的方法,扩增抗汉坦病毒核囊膜蛋白和表面糖蛋白单链抗体基因1A8 ScFv和3G1 ScFv,将人源鱼精蛋白片段的编码序列设计入扩增引物,获得HV单链抗体/鱼精蛋白片段的融合蛋白基因ScFv-Cκ-tP。将获得的重组基因克隆入原核表达载体pET28a、pET32a,并在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定,用Ni-NTA螯合层析介质进行纯化。采用ELISA方法分析ScFv-Cκ-tP融合蛋白与HV抗原的结合活性,凝胶迁移阻滞实验检测ScFv-Cκ-tP融合蛋白与质粒DNA的结合活性。免疫荧光试验分析蛋白的内化活性。结果:经酶切鉴定及测序证实:扩增的目的基因序列正确,成功构建了HV ScFv-Cκ-tP融合蛋白基因的表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS用IPTG原核诱导表达,SDS-PAGE证实融合蛋白成功表达,在大肠杆菌中实现了可溶性表达。并且利用Ni-NTA螯合层析介质使之得到有效纯化。ELISA检测证实融合蛋白均具有HV结合活性,凝胶迁移实验结果提示含tP的融合蛋白具有DNA结合活性。通过功能活性测定,纯化的scFv-Cκ-tP融合蛋白既保持了与HV抗原的结合能力,同时又具有与核酸的结合活性。蛋白的内化活性分析试验表明蛋白与细胞表面的抗原结合后可以特异性地内化入感染细胞的细胞浆,即具有内化的活性。结论:成功构建了HV抗原单链抗体/鱼精蛋白片段重组基因的原核表达载体,经IPTG诱导表达和纯化后,证实该融合蛋白具有DNA结合活性,同时融合蛋白能特异性识别汉坦病毒感染细胞并内化进入细胞。本研究所构建的融合蛋白可以携带治疗性DNA或siRNA靶向识别汉坦病毒感染细胞,为肾综合征出血热的治疗提供了新的思路。

论文目录

  • 缩略语表
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 文献回顾
  • (一) 汉坦病毒(HV)感染疾病治疗研究进展
  • (二) 单链抗体融合蛋白在生物治疗中的应用
  • (三) 靶向性非病毒载体系统介导的基因转移
  • (四) siRNA的研究进展
  • 正文
  • 第一部分 抗HV单链抗体/ Cκ/protamine截短体融合蛋白的基因构建
  • 1. 实验材料
  • 1.1 菌种与质粒
  • 1.2 主要试剂
  • 1.3 主要溶液配制
  • 1.4 主要仪器
  • 2. 实验方法
  • 2.1 PCR引物设计与合成
  • 2.2 ScFv及ScFv-Cκ基因的获得
  • 2.3 ScFv及ScFv-Cκ、ScFv-Cκ-tP基因的扩增及纯化
  • 2.4 基因重组表达质粒的构建
  • 2.5 感受态细胞的制备
  • 2.6 宿主菌的转化
  • 2.7 挑取阳性克隆,鉴定并测序
  • 3. 实验结果
  • 3.1 重组质粒的结构
  • 3.2 ScFv及ScFv-Cκ基因获得
  • 3.3 目的基因的扩增及鉴定
  • 第二部分 抗HV单链抗体/ Cκ/protamine截短体融合蛋白的表达、纯化
  • 1. 实验材料
  • 1.1 菌种与质粒
  • 1.2 主要试剂
  • 1.3 主要溶液配制
  • 1.4 主要仪器
  • 2. 实验方法
  • 2.1 融合蛋白基因的诱导表达与鉴定
  • 2.2 重组融合蛋白表达的可溶性分析
  • 2.3 表达产物的Western blot鉴定
  • 2.4 表达产物的纯化
  • 2.5 纯化蛋白的定量和保存
  • 3 实验结果
  • 3.1 融合基因的诱导表达与鉴定
  • 3.2 重组融合蛋白表达的可溶性分析
  • 3.3 表达产物的Western blot鉴定
  • 3.4 表达产物的纯化
  • 3.5 纯化蛋白的定量
  • 第三部分 抗HV单链抗体/ Cκ/protamine截短体融合蛋白功能的研究
  • 1. 试验材料
  • 1.1 细胞系及病毒株
  • 1.2 主要试剂
  • 1.3 主要溶液配制
  • 1.4 主要仪器
  • 2. 实验方法
  • 2.1 表达产物抗原结合活性的细胞ELISA检测
  • 2.2 表达产物的DNA结合活性检测
  • 2.3 直接免疫荧光检测融合蛋白的内化活性
  • 3. 实验结果
  • 3.1 表达产物的抗原结合活性的细胞ELISA检测
  • 3.2 表达产物的DNA结合活性检测
  • 3.3 蛋白的内化活性分析
  • 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 个人简历和研究成果
  • 致谢
  • 相关论文文献

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