论文摘要
目的:肾综合征出血热(HFRS)是由汉坦病毒引起的一种严重危害人类健康的传染性疾病,一旦暴发有很高的病死率,目前尚无特效疗法。本研究构建了抗汉坦病毒(Hantavirus, HV)抗原的单链抗体和鱼精蛋白片段的重组基因,并在大肠杆菌中表达、纯化后,进行融合蛋白的功能活性鉴定,期望获得一种汉坦病毒特异性的靶向核酸运输载体。方法:采用重组PCR的方法,扩增抗汉坦病毒核囊膜蛋白和表面糖蛋白单链抗体基因1A8 ScFv和3G1 ScFv,将人源鱼精蛋白片段的编码序列设计入扩增引物,获得HV单链抗体/鱼精蛋白片段的融合蛋白基因ScFv-Cκ-tP。将获得的重组基因克隆入原核表达载体pET28a、pET32a,并在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定,用Ni-NTA螯合层析介质进行纯化。采用ELISA方法分析ScFv-Cκ-tP融合蛋白与HV抗原的结合活性,凝胶迁移阻滞实验检测ScFv-Cκ-tP融合蛋白与质粒DNA的结合活性。免疫荧光试验分析蛋白的内化活性。结果:经酶切鉴定及测序证实:扩增的目的基因序列正确,成功构建了HV ScFv-Cκ-tP融合蛋白基因的表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS用IPTG原核诱导表达,SDS-PAGE证实融合蛋白成功表达,在大肠杆菌中实现了可溶性表达。并且利用Ni-NTA螯合层析介质使之得到有效纯化。ELISA检测证实融合蛋白均具有HV结合活性,凝胶迁移实验结果提示含tP的融合蛋白具有DNA结合活性。通过功能活性测定,纯化的scFv-Cκ-tP融合蛋白既保持了与HV抗原的结合能力,同时又具有与核酸的结合活性。蛋白的内化活性分析试验表明蛋白与细胞表面的抗原结合后可以特异性地内化入感染细胞的细胞浆,即具有内化的活性。结论:成功构建了HV抗原单链抗体/鱼精蛋白片段重组基因的原核表达载体,经IPTG诱导表达和纯化后,证实该融合蛋白具有DNA结合活性,同时融合蛋白能特异性识别汉坦病毒感染细胞并内化进入细胞。本研究所构建的融合蛋白可以携带治疗性DNA或siRNA靶向识别汉坦病毒感染细胞,为肾综合征出血热的治疗提供了新的思路。
论文目录
相关论文文献
- [1].中国医药城首批融合蛋白试剂出口[J]. 泰州科技 2010(08)
- [2].脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟表位的2种融合蛋白的表达及其在无毒酶联免疫吸附方法中的应用[J]. 食品科学 2014(08)
- [3].线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2与心肌细胞生理机能关系的研究进展[J]. 中国胸心血管外科临床杂志 2013(04)
- [4].rhLFA-3:Fc融合蛋白连续静脉注射对食蟹猴长期毒性实验研究[J]. 中国新药杂志 2013(10)
- [5].猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3-GP5-M融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达[J]. 农业生物技术学报 2012(10)
- [6].线粒体融合蛋白-2与心血管疾病[J]. 心血管病学进展 2011(02)
- [7].线粒体融合蛋白2研究新进展[J]. 生物化学与生物物理进展 2010(03)
- [8].GST-Glypican 3 N端融合蛋白表达载体构建及表达纯化[J]. 临床检验杂志 2010(03)
- [9].小反刍兽疫病毒融合蛋白基因的克隆、序列分析及表达[J]. 石河子大学学报(自然科学版) 2011(01)
- [10].重组人酸性成纤维细胞生长因子-穿膜肽融合蛋白的克隆表达、纯化及活性检测[J]. 吉林大学学报(医学版) 2010(05)
- [11].线粒体融合蛋白2与心血管疾病[J]. 生理科学进展 2010(01)
- [12].穿膜肽-EGFP融合蛋白的表达、纯化与鉴定[J]. 基础医学与临床 2010(09)
- [13].pTWIN1-EgAgB8/3自剪切融合蛋白原核表达载体的构建及表达[J]. 中国人兽共患病学报 2013(02)
- [14].毕赤酵母工程菌株表达人溶菌酶-鲎素融合蛋白发酵条件的优化[J]. 动物医学进展 2011(08)
- [15].乙型肝炎病毒前-X融合蛋白结合蛋白的筛选[J]. 中国肝脏病杂志(电子版) 2010(02)
- [16].重组鸡干扰素/白细胞介素-2融合蛋白体内抗传染性法氏囊病病毒作用研究[J]. 中国预防兽医学报 2014(02)
- [17].对氧磷酶1融合蛋白的表达及其生物活性[J]. 国际药学研究杂志 2014(03)
- [18].人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白的表达与功能鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2012(04)
- [19].人源抗EGFR抗体-鱼精蛋白融合蛋白的制备及活性分析[J]. 南京医科大学学报(自然科学版) 2011(05)
- [20].表达犬瘟热病毒融合蛋白基因重组腺病毒的构建与鉴定[J]. 东北农业大学学报 2010(09)
- [21].线粒体融合蛋白2改善高脂诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗机制的研究[J]. 中国糖尿病杂志 2014(11)
- [22].人源醛酮还原酶7A2融合蛋白的纯化及其对苯代谢产物的催化活性[J]. 中国医科大学学报 2013(01)
- [23].细胞毒淋巴细胞相关抗原4融合蛋白靶向树突状细胞作用的体外研究[J]. 口腔医学研究 2012(01)
- [24].制备可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白的两种细胞培养工艺比较[J]. 生物工程学报 2013(01)
- [25].人呼吸道合胞病毒融合蛋白(F)片段原核表达、纯化和鉴定[J]. 微生物学免疫学进展 2012(01)
- [26].蜂毒肽融合蛋白在裂殖酵母中的表达研究[J]. 药物生物技术 2010(01)
- [27].Cry1Ab/Ac融合蛋白的安全评估[J]. 农业生物技术学报 2013(12)
- [28].提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2014(05)
- [29].重组人肿瘤坏死因子受体融合蛋白对大鼠佐剂性关节炎滑膜细胞功能的影响[J]. 中国新药杂志 2013(10)
- [30].甲基硒酸抑制肾癌细胞生长及与线粒体融合蛋白2关系的研究[J]. 贵州医药 2012(08)