草菇（Volvarella volvacea）中葡聚糖内切酶在分泌途径中的定位及超微结构元件的分析与研究

论文题目: 草菇（Volvarella volvacea）中葡聚糖内切酶在分泌途径中的定位及超微结构元件的分析与研究

论文类型: 硕士论文

论文专业: 微生物学

作者: 孙芳芳

导师: 潘迎捷,邢增涛

关键词: 草菇,葡聚糖内切酶,分泌途径,定位,超微结构,鉴定

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 草菇在生长发育过程中会合成和分泌多种纤维素降解酶，以降解和利用棉籽壳、木屑、稻草等纤维素类培养料，但因为纤维素大分子不可能直接进入菌丝体内，因此菌丝合成的纤维素降解酶必须分泌到菌丝体外才能发挥作用。前期研究表明V.volvacea可以产生三种纤维素酶即内切型纤维素酶(EC3．2．1．4)，外切型纤维素酶(EC3．2．1．9．1)和β-葡萄糖苷酶(EC3．2．1．21)等多种成分。本实验选择了内切型纤维素酶即葡聚糖内切酶EG1作为研究对象，重点研究了葡聚糖内切酶EG1在转录水平上的脉冲表达规律、在草菇菌丝中的定位及其分泌途径中涉及到的超微结构元件。Ding等已经对葡聚糖内切酶EG1的一些性质进行过深入研究，研究表明EG1的分子量为42KDa，等电点为7.65，最适PH和温度分别为7.5和55℃。在本实验中首先研究了葡聚糖内切酶基因eg1在V.volvacea中的表达是在转录水平上受诱导和代谢物抑制调控的，α-乳糖既为诱导物又为抑制物，加入α-乳糖于含有1％山梨醇的基本培养基中，3个小时后用RT-PCR方法检测到eg1的诱导表达，在6小时表达信号最强，随后9小时表达减弱，12小时后表达变得非常弱，24小时后，eg1的表达被强烈抑制。RT-PCR分析以gpd基因(三磷酸甘油醛脱氢酶基因)为内参基因。实验中用凝胶层析和制备型凝胶电泳纯化在毕赤酵母P.pastoris中获得高效分泌表达的重组葡聚糖内切酶EG1，然后用纯化的EG1来亲和层析纯化葡聚糖内切酶一级抗体，并做Western blotting验证了纯化的一级抗体的纯度及特异性。实验中用共聚焦激光扫描显微镜和免疫荧光标记方法来观察α-乳糖诱导与抑制循环中分泌的葡聚糖内切酶在草菇菌丝中的定位。首先将菌丝用葡聚糖内切酶一级抗体标记，然后用荧光染料Rhodamine结合的二级抗体进行标记，随后用共聚焦激光扫描显微镜观察到草菇菌丝中分泌的葡聚糖内切酶主要定位在菌丝细胞壁周围，标记荧光从菌丝尖端延伸大约60-80微米，且菌丝细胞壁周围能观察到明显的免疫荧光的信号强弱变化：乳糖诱导3小时后，可观察菌丝细胞壁周围有很弱但是唯一的免疫荧光信号，乳糖诱导6小时到8小时后，可在菌丝细胞壁周围观察到很强的免疫荧光信号，而9小时后免疫荧光开始减弱，12小时后荧光变得很弱。在未诱导菌丝中未观察到荧光标记。实验中用透射电镜和免疫金标记的方法来观察α-乳糖诱导与抑制循环中葡聚糖内切酶在菌丝中的分泌过程及分泌过程中涉及的超微组织结构。首先将菌丝包埋后的切片用葡聚糖内切酶一级抗体标记，然后用免疫胶体金颗粒(12nm)结合的二级抗体进行标记，随后用透射电镜观察表明草菇菌丝中葡聚糖内切酶的分泌经过内质网和液泡等组织结构，最终葡聚糖内切酶由小液泡携带至质膜处，与质膜融合后经过细胞壁而分泌到外部空间。以上实验结果初步分析了草菇菌丝体中葡聚糖内切酶分泌途径中的超微结构元件及这些元件在菌丝体中的空间分布模式，确定了该酶分泌的动力学机制。本研究结果对进一步深入研究草菇纤维素降解酶的合成和分泌，提高草菇生物学效率和产量奠定了基础，并对其它丝状真菌蛋白质分泌途径的研究提供参考。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章 文献综述

1.草菇概况

1.1 草菇的分类地位

1.2 草菇栽培的起源与发展

1.3 草菇菌丝的生态与习性

1.4 草菇的生殖和生活史

1.5 草菇的营养价值与药用价值

2.纤维素酶合成的调控

3.葡聚糖内切酶(Endoglucanase)

4.真菌的蛋白质分泌途径的研究

4.1 蛋白质分泌途径中可能涉及的超微结构

4.1.1 内质网(The endoplasmic reticulum)

4.1.2 高尔基体(Golgi apparatus)

4.1.3 液泡(Vesicles)

4.2 真菌蛋白质分泌研究意义及国内外研究现状和分析

4.3 非折叠蛋白信号

5.研究背景及意义

6.工作假说和研究意义

第二章 研究内容和实验方法

1.试验材料

1.1 供试菌株

1.2 基本生长培养基

2.试验方法

2.1 草菇菌丝的培养

2.1.1 乳糖诱导表达规律

2.1.2 共聚焦激光扫描显微镜观察

2.1.3 透射电子显微镜观察

2.2 生物化学分析

2.2.1 葡聚糖内切酶酶活测定

2.3 半定量PCR(Semi-quantitative PCR)

2.3.1 提取草菇菌丝的总RNA

2.3.2 酶解总RNA中的DNA

2.3.3 RNA的电泳

2.3.4 mRNA的反转录

2.3.5 模板cDNA的相对定量

2.3.6 目的基因的PCR扩增

2.3.7 扩增DNA片段的纯化和回收

2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.5 重组葡聚糖内切酶纯化

2.6 葡聚糖内切酶一级抗体的制备、纯化及Western blotting试验

2.7 共聚焦激光扫描显微镜样品的准备

2.8 透射电镜观察样品准备

第三章 结果分析与讨论

1.草菇葡聚糖内切酶基因经乳糖诱导的脉冲转录规律分析

1.1 总RNA的提取

1.2 RNA的甲醛变性凝胶电泳

1.3 选择oligo(dT)_(18)作为锚定引物

1.4 gpd基因和egl基因引物

1.5 半定量PCR的有效性分析

1.6 gpd基因和egl基因在最佳循环数条件下的PCR扩增

1.7 gpd基因和egl基因序列

2.重组葡聚糖内切酶的纯化

3.葡聚糖内切酶亲和层析柱化一级抗体

4.葡聚糖内切酶Western blotting结果

5.葡聚糖内切酶共聚焦激光扫描显微镜观察

6.葡聚糖内切酶透射电镜结果

7.讨论

8.结论

参考文献

附录1 供试培养基

附录2 试验试剂

附录3 使用仪器

附录4 文中所用缩写

致谢

攻读硕士学位期间发表论文

发布时间: 2006-10-20

参考文献

• [1].赞比亚引种试种草菇的初步研究[D]. 陆珠.吉林农业大学2017
• [2].中国草菇主产区栽培品种种质评价及资源库的建立[D]. 杨维丽.吉林农业大学2012
• [3].草菇遗传转化体系建立的研究[D]. 熊盛.华南热带农业大学2002
• [4].北方寒冷地区草菇工厂化栽培全年能耗模拟分析[D]. 张瑜琴.西安建筑科技大学2008
• [5].草菇半纤维素相关酶活性及其基因表达研究[D]. 王孟兰.南京农业大学2014
• [6].草菇主产区优质和耐低温菌株的筛选[D]. 敖莉.吉林农业大学2012
• [7].草菇自交和杂交菌株筛选[D]. 赖佳忠.福建农林大学2013
• [8].低温胁迫下草菇抗氧化应答反应中关键酶的表达量变化及活性研究[D]. 姜威.南京农业大学2014
• [9].采后不同时期的草菇菌柄表达谱差异分析[D]. 鄢淑琴.福建农林大学2011
• [10].草菇基因组测序及遗传连锁图构建[D]. 章小寅.福建农林大学2011

相关论文

• [1].草菇糖苷水解酶家族5纤维素酶的定向改造[D]. 张达.南京林业大学2011
• [2].编码草菇中性内切葡聚糖酶Ⅰ基因（eg Ⅰ）的克隆与表达研究[D]. 王超凯.江南大学2008
• [3].草菇在低温下冷诱导基因表达变化研究及其与草菇低温自溶相关性分析[D]. 乔娜.南京农业大学2008
• [4].草菇乙酰木聚糖酯酶的重组表达及其酶学特性[D]. 曹杰.南京林业大学2007
• [5].草菇木聚糖降解酶系基因诱导表达调控机理研究[D]. 杨红军.南京林业大学2007
• [6].不同碳源条件下草菇（Volvariella volvacea）葡聚糖内切酶诱导表达的分析[D]. 裴云.南京林业大学2008
• [7].草菇分子标记辅助育种研究[D]. 李刚.福建农林大学2008
• [8].不同草菇菌株特性研究与分子标记辅助杂交育种[D]. 陈剑.福建农林大学2006
• [9].草菇低温诱导蛋白的分离纯化及其酶解片段的N端序列分析[D]. 戴志刚.南京农业大学2003
• [10].草菇耐低温菌株的诱变选育与分子生物学鉴定[D]. 韩业君.南京农业大学2004

标签：草菇论文;  葡聚糖内切酶论文;  分泌途径论文;  定位论文;  超微结构论文;  鉴定论文;