论文摘要
研究背景及目的:大量临床回顾性研究资料表明,在伴有海马硬化性颞叶癫痫的成人患者中有相当高比例可追问到儿童早期有长时间痫性发作史,尤其是高热惊厥。幼年早期长时间痫性发作后大脑可塑性发生的改变对个体能产生长远的影响,与海马硬化性颞叶癫痫的形成密切相关。海马环路内的轴突出芽、突触重建是颞叶癫痫的主要的病理生理特征,在颞叶癫痫的形成与维持中发挥重要作用。在癫痫形成过程中,神经元之间形成异常的突触联系,建立了病理性（功能性或形态性）神经环路。海马突触联系的可塑性是癫痫发生后突触重建的基础。癫痫发作可导致神经系统胶质增生,突触后终端与胶质细胞之间形成突触,突触后终端的树突棘的形态学的变化引起突触结构的改变,与胶质细胞之间形成的突触为异位突触;同时痫性发作也导致异常神经发生,引起颗粒细胞层弥散,新生的颗粒神经元有较多的基部树突向齿状回投射,引起海马内环路性质的变化,成为慢性反复性痫性发作的基础。环氧合酶—2（COX-2）及其代谢产物在中枢起多种调节作用,与长时程突触可塑性形成和突触重构密切相关。近年许多研究均发现长时间痫性活动发作后,COX-2在脑内迅速被诱导激活,在大脑皮层、海马、杏仁核等处广泛表达。许多研究表明COX-2抑制剂能明显对抗戊四氮诱导的惊厥发作,且在电休克诱导的惊厥模型中,苯妥因联合COX-2抑制剂能增强其抗惊厥作用。目前有关COX-2在癫痫是否参与了颞叶癫痫海马环路内突触重建,从而促进了颞叶癫痫的形成与发展尚不清楚,且其抑制剂抗惊厥的作用机制国内外均未见有进一步深入的研究。本研究旨在研究COX-2在痫性发作活化后的表达特点,看COX-2抑制剂是否能通过抑制COX-2的活性来纠正痫性活动引起脑内微环境改变所致的海马异常突触重构,从而减少慢性期自发性反复性痫性发作（SRS）的发生,研究其在痫性发作后突触重构密切相关的异常神经发生及胶质细胞活化和增生等事件中的作用及发挥作用的细胞信号转导途径。COX-2抑制剂对痫性发作后海马结构和功能改变这种长时程事件的影响是通过对神经元突触电活动的影响而实现的,可能和影响神经递质释放及改变离子通道通透性等有关。而Na+离子通道是许多抗癫痫药物的治疗靶点。我们通过建立体外海马脑组织切片痫样放电模型,向脑片灌流液中加入COX-2抑制剂,观察其对海马CA1椎体神经元膜兴奋特性、钠离子通道及突触活动的影响,从多角度、多层次来研究COX-2及其抑制剂在幼鼠痫性发作中的作用及其机制,看能否提供新的控制癫痫发作的治疗策略和预防靶点。方法:1.体内部分实验:模型制作:随机将120只体重为50～60g的3周龄健康Wistar幼鼠分为匹鲁卡品致痫组（EP—Only组）（n=45）和塞莱昔布干预致痫组（EP—Celecoxib）（n=45）和生理盐水正常对照组（NS组）（n=30）3组。匹鲁卡品癫痫模型的建立:腹腔注射10%匹鲁卡品350 mg/kg,若注射匹鲁卡品后30min无惊厥发作,再按每次10mg/kg追加匹鲁卡品,若惊厥发作持续30min（定为癫痫持续状态的标准）仍未停止,则给予10%水合氯醛400mg/kg腹腔注射,及时终止发作。EP—Celecoxib组大鼠在注射东莨宕碱前45min预先通过胃管灌入20mg/kg.d的塞莱昔布,腹腔注射完匹鲁卡品后每天均按此剂量灌胃,直至动物被处死。随机在EP-only及EP-Celecoxib组各取10只匹鲁卡品成功诱导急性发作幼鼠进行腹腔注射BrdU,剂量100mg/kg,从急性发作当天开始,隔天注射一次,直到发作后第14天。（1）动物行为学观察:根据Racine分级评价痫性发作行为。观察急性期癫痫幼鼠痫性发作行为在各组的差异,监测慢性期（急性发作后28～42天）自发性反复性发作（SRS）的发生率及发作强度在各组的差异。（2）形态学检测:各试验组分别在急性发作后第14天,28天处死大鼠制备组织切片。①Nissl染色:检测海马神经元损伤及丢失情况;②免疫组织化学方法:检测指标有COX-2、C-fos及p-ERK1/2阳性细胞在各组的表达变化趋势,OX-42标记少突胶质细胞的活化,比较小胶质细胞的活化在各组的差异;BrdU标记增殖的新生细胞,NeuN为特异性神经元标志,GFAP为星型胶质细胞特异性标志,BrdU+NeuN荧光免疫双标标记痫性发作后新生神经元,BrdU+GFAP免疫双标标记增生的星型胶质细胞,观察神经前体细胞的增殖及分化在各组的差异;（3）western blot方法:检测COX—2、C-fos、ERK1、ERK2及磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白水平在痫性发作后1h、1d、4d、7d、14d、28d各时点的表达及变化趋势,比较在匹鲁卡品诱导SE后的静止期其表达水平在各组的表达是否有差异,探讨COX-2及其抑制剂发挥作用的细胞信号转导途径。2.体外试验部分:离体海马脑片痫样放电模型的建立:生后14天龄SD大鼠,快速断头取脑后用振动切片机切成400μm海马组织脑切片,用电刺激诱发CA1区锥体神经元记录场电位,以群峰电位（PS）个数和幅度的变化来评价脑片放电的变化,灌流不同浓度青霉素,观察到药物作用约3min后PS个数增多和幅度增加,有明显的癫痫样放电,建立离体海马脑片痫样放电模型,从以下几方面来观察COX-2抑制剂NS-398对痫性放电后海马锥体神经元电生理特性的影响:（1）COX-2抑制剂NS—398对青霉素致痫脑片CA1场电位的影响:脑片灌流液中灌流不同浓度NS-398,观察对PS个数和幅度的影响;（2）脑片全细胞记录技术研究NS-398对青霉素致痫幼鼠海马脑片CA1区锥体神经膜兴奋特性的影响,分析对动作电位幅度、频率、潜伏期和时程的影响;（3）通过给予不同阶跃模式的电压刺激,观察NS-398对电压依赖性钠离子通的影响,分别研究对其激活曲线和失活曲线的影响;（4）全细胞记录Gap—free模式下,观察NS—398对海马CA1锥体神经元递质释放和突触活动的影响,分别记录自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）和自发性抑制性突触后电流（sIPSCs）,观察NS—398对其幅度和频率的影响。结果:1.体内实验部分:（1）动物行为学观察:匹鲁卡品腹腔注射后,致痫成功率72.2%,动物总死亡率8.9%,模型成功率63.3%。急性癫痫持续状态（SE）后24—30小时进入静止期,28～42天出现SRS。生理盐水对照组未出现急性期痫性发作及慢性期自发发作。①急性期:EP-only组全身性惊厥发作率（89.9%）明显高于EP-Celecoxib组（55.6%）（P＜0.01）;EP-only组痫性发作Racine分级强度（3.7±1.3）明显高于EP-Celecoxib组发作强度（2.5±1.1）（P＜0.05）;②慢性期监测:在EP-Only组SRS发生率（50%）明显高于EP-Ceelecoxib组（30%）（p＜0.05;x2 test）;EP-Only组平均每天SRS发生的频率（1.9±0.58）明显高于EP-Celecoxib组（0.6±0.3）（p＜0.01,t test）;（2）形态学检测结果:①Nissl染色结果:匹鲁卡品诱导痫性发作14天后,海马CA1、CA3及门区均有明显受损的异常神经元及神经元的丢失,但EP-Only组各区神经元丢失均较EP-Celecoxib组多（CA1区48%vs25%;CA3区36.3%vs24%;门区46%vs22%）;②免疫组化结果:Ⅰ.COX-2免疫反应阳性细胞的表达:匹鲁卡品致痫14天后,海马区COX-2阳性细胞表达在EP-Only组明显高于EP-Celecoxib组（158±18 VS 118±20）（p＜0.01）;Ⅱ.小胶质细胞活化标志物OX-42免疫阳性细胞的表达:OX-42阳性细胞的数量在致痫后14天EP-Only组明显高于EP-Celecoxib组（p=0.005）,;Ⅲ.BrdU+NeuN和Brdu+GFAP免疫双标结果:急性期发作28天后,BrdU+NeuN免疫双标阳性细胞在EP-Only组明显高于EP-Celecoxib组（36±4 Vs 22±3）;同时EP-Only组门区有Brdu+GFAP免疫双标阳性的新生的胶质细胞明显比EP-Celecoxib组高（26±3 Vs 14±2）,COX-2抑制剂能抑制胶质细胞的生成;（3）western blot结果:①COX-2蛋白的表达:正常对照组海马表达极低量COX-2蛋白,SE后1小时表达急剧增高达高峰,后表达水平逐渐下降,但在28天仍高于正常对照组。而在塞莱昔布处理组中,COX-2的表达明显较EP-Only组降低。在急性发作后4天,COX-2在EP-Only组的表达是EP-Celecoxib组的1-3倍,14天时前者是后者的1.5倍;②C—fos蛋白浓度在致痫后静止期各时点,EP-only组表达均较EP-Celecoxib组高,且均在致痫后1d达高峰后逐渐下降,致28天时浓度水平与对照组无明显差异（P＞0.05）;③MAPK/ERK信号系统的活动和表达:匹鲁卡品致痫后1h磷酸化ERK1/2水平迅速升高,1d达高峰为正常组的近10倍,塞莱昔布干预组各时点磷酸化ERK1/2表达显著低于EP-Only组（p＜0.01）但仍高于对照组（p＜0.01）。非磷酸化的ERK1和ERK2在海马的表达强度高于磷酸化ERK1/2,但在幼鼠痫性发作后无明显增强（p＞0.05）。2.体外实验部分:（1）COX-2抑制剂NS-398对青霉素诱导的海马痫样放电的影响:NS-398浓度为10μM时,对青霉素诱发的癫痫样放电没有多大的抑制效应。20μM有明显的抑制作用,30μM抑制作用很强,明显降低PS的幅度和减少其频率;（2）NS—398对电压依赖性钠电流的影响:NS-398能降低电压依赖性钠通道的电流幅度以及延长钠通道的不应期,加陶冶20μM NS-398不能明显改变钠通道的电压依赖性激活状态（P＞0.05）,但加入20μM NS-398,电压依赖性钠失活电流的失活曲线明显向负极化方向移动,NS-398能明显延长电压依赖性钠电流的失活时间,COX-2抑制海马神经元放电是通过延长钠通道的失活时相而实现的导致钠通道开放频率下降,神经元发放动作电位频率也相应下降;（3）NS—398对动作电位的影响:COX-2抑制剂能抑制动作电位的幅度和传播频率、延长动作电位的潜伏期和时程来延迟锥体神经元动作电位的传导,最终导致兴奋性神经递质的发放的减少;（4）对神经元自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）和自发性抑制性突触后电流（sIPSCs）的影响:NS-398能明显抑制致痫大鼠海马锥体神经元sEPSCs的频率,但是对其幅度及衰减没有明显的影响;同时NS-398能明显增强致痫大鼠海马脑片锥体神经元sIPSCs的频率,明显延长sIPSCs的衰减时间,对电流幅度影响不大。结论:1.COX-2在痫性发作后被迅速诱导表达,COX-2抑制剂能抑制痫性发作及发作后COX-2的活化;2.COX-2抑制剂能减少痫性发作后海马神经元的死亡,抑制小胶质细胞的活化,抑制痫性发作激活的异常神经发生和星型胶质细胞增生,纠正痫性发作后海马异常可塑性的发生,从而减少慢性期SRS的发生;3.COX-2抑制剂逆转海马异常可塑性的发生是通过抑制痫性发作激活的MAPK/ERK信号转导途径及其下游信号分子C—fos而发挥效应;4.COX-2抑制剂能延长海马锥体神经元钠离子通道失活时间,减少动作电位的发放,减少sEPSCs的发放和增强sIPSCs的抑制功能,导致兴奋性神经递质的释放减少,降低神经元的兴奋性,从而抑制神经元异常放电;5.COX-2的活化在痫性发作中发挥重要作用,COX-2抑制剂能防止慢性期癫痫的形成,降低神经元的兴奋性,可能为难治性癫痫提供新的预防途径和治疗靶点。