鸡传染性支气管炎病毒2006～2007年东北地区分离株分子流行病学研究

论文摘要

本研究从东北三省分离到2006～2007年间的9株IBV病毒,对其生物学特性进行了研究,同时对IB病毒基因组的S1基因序列进行了测定、分析和比较,说明东北三省IBV毒株之间以及与我国其余典型毒株和其他参考毒株之间基因的遗传变异情况,并且构建系统进化树,分析东北三省IBV分离株与参考株之间的系统进化关系,探讨了东北三省IB流行的背景和原因。现地濒死病鸡病变组织处理后经鸡胚尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚。盲传6～10代后,鸡胚生长发育明显受到抑制,出现侏儒胚,卷曲胚或畸形胚等现象。各代鸡胚尿囊液均不能使鸡外周血红细胞发生凝集;电镜下可见到直径约为80～120nm的典型冠状病毒粒子,病毒粒子多数为圆形,有囊膜,表面有呈松散、均匀排列的冠状突起,而且未观察到有其它病毒。鸡新城疫干扰试验表明9株分离株对于NDV La Sota毒株的增殖具有明显的抑制作用,该现象为IB所特有。所以可初步断定本研究所分离的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。本实验应用RT-PCR方法扩增到了我国东北地区2006～2007年的9株IBV现地分离株基因组中最易发生变异的部位S1基因,并以疫苗株H120等毒株作为参考株,对9株IBV的分子特征进行了研究分析,从而进一步从分子水平上证明9株分离株均为IBV病毒。将9株IBV分离株S1基因序列进行比较发现,他们之间S1基因核苷酸同源性为76.1%～99.4%。其中HLJ0605、HLJ0708、JL0712、LN071001、TL0608之间S1基因核苷酸同源性为94.1%～97.9%:HLJ0751、HLJ0752、LN071002、MDJ0610之间S1基因核苷酸同源性为96.9%～99.5%。其中,HLJ0752、MDJ0610、LN071002之间S1基因核苷酸同源性较高:HLJ0752和MDJ0610之间同源性为99.4%,HLJ0752和LN071002之间同源性为99.5%;MDJ0610和LN071002之间同源性为98.8%。但是HLJ0605、HLJ0708、JL0712、LN071001、TL0608与HLJ0751、HLJ0752、LN071002、MDJ0610之间同源性很低,仅为76.1%～79.3%。根据血清中和试验结果以及本研究中的9株IBV分离株与我国其他IBV分离株、我国常用疫苗株、国外参考毒株共47株毒株绘制的系统进化树发现:47株IBV分为8个基因型,本研究中2006～2007年分离的IBV毒株分布在第Ⅰ、Ⅳ、Ⅷ个群中。经过对东北三省2006～2007年间9株IBV分离株的S1基因的比较分析结果可知:东北三省IBV分离株存在较为广泛的基因突变、插入、缺失和IBV毒株间的基因重组,这些是造成IBV毒株变异的主要原因。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 鸡传染性支气管炎
• 1.2 鸡传染性支气管炎流行病学的国内外研究现状
• 1.2.1 鸡传染性支气管炎的国外流行情况
• 1.2.2 鸡传染性支气管炎的国内流行情况
• 1.3 鸡传染性支气管炎病毒概述
• 1.3.1 IBV分类地位
• 1.3.2 IBV病毒粒子结构
• 1.3.3 鸡传染性支气管炎病毒基因组
• 1.4 IBV变异机制及生物进化
• 1.4.1 IBV变异理论基础
• 1.4.2 变异原因
• 1.5 IBV基因分型研究进展
• 1.6 研究目的和意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病料的收集
• 2.1.2 鸡胚、鸡红细胞及SPF鸡
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 标准毒株
• 2.1.6 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 病毒的分离
• 2.2.2 病毒的鉴定
• 50测定'>2.2.3 EID₅₀测定
• 2.2.4 标准血清的制备
• 2.2.5 中和试验
• 2.2.6 病毒基因组 RNA的提取
• 2.2.7 RT-PCR扩增
• 2.2.8 RT-PCR产物鉴定及纯化回收
• 2.2.9 RT-PCR产物连接与转化
• 2.2.10 重组质粒的提取、鉴定及序列测定
• 2.2.11 基因序列的确定及系统进化树分析
• 3 结果
• 3.1 病毒的鉴定
• 3.1.1 IBV-HA试验
• 3.1.2 鸡胚矮小化试验
• 3.1.3 鸡新城疫干扰试验
• 3.1.4 电镜
• 3.1.5 S1基因的RT-PCR
• 50测定'>3.2 EID₅₀测定
• 3.3 血清中和试验结果
• 3.4 分离株S1基因序列分析
• 3.4.1 分离株S1基因的序列分析
• 3.4.2 分离株S1基因同源性分析
• 3.4.3 IBV分离株S1基因序列的系统进化树分析
• 3.4.4 分离株S1蛋白氨基酸的缺失和插入比较
• 4 讨论
• 4.1 各种分离鉴定方法
• 4.1.1 血凝试验
• 4.1.2 鸡胚矮小化试验
• 4.1.3 NDV干扰试验
• 4.1.4 形态学观察
• 4.1.5 RT-PCR方法
• 4.1.6 分离株S1基因序列测定结果的鉴定
• 4.2 血清分型
• 4.3 分离株S1基因序列的变异情况及遗传衍化关系
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文