保肝宁颗粒剂抗肝纤维化的主要药效学研究

论文摘要

研究背景肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化共有的病理改变。肝纤维化的形成主要是由于肝炎病毒、酒精、药物、毒物、血吸虫等多种损伤因素长期刺激肝脏，使肝窦内肝星状细胞（hepatic stellate cell HSC）活化，肝组织内细胞外基质（extracellular matrix ECM）成分过度增生与异常沉积，导致肝脏结构或（和）功能异常。引起肝纤维化的病因中，国外尤其是欧美国家，以酒精性肝损伤为主；国内主要原因是感染肝炎病毒，尤其是乙肝病毒的持续感染。抗纤维化的治疗一般包括两个方面：①是针对原发病的病因治疗，如抗肝炎病毒、抗血吸虫病、戒酒、去铁和去铜等；②是针对肝纤维化本身的治疗，如抑制HSC的激活、抑制胶原的增生、促进胶原的降解等。现代医学中抗肝纤维化的药物诸如干扰素、秋水仙碱、D-青霉胺、拉米夫定、肿瘤坏死因子-α、前列腺素、白介素-2等因不良反应大，价格昂贵等因素，在临床应用中受到限制。中医中药抗肝纤维化的研究，已从单味药的研究发展到复方的研究；从单一方法的研究发展到辨证论治数法相合的研究；从整体动物模型研究发展到细胞或分子水平的研究等。保肝宁颗粒剂是导师吕志平教授根据多年的临床实践，首次提出肝炎后肝纤维化的病因病机为“湿热余毒未尽，肝郁气滞、瘀热互结阻络”，并以黄芩、丹参等组方研制的新药，在南方医院中医科初步临床试验证明，其有较好的抗肝纤维化疗效，在全军医药卫生科研基金及国家自然基金的资助下，对保肝宁进行了抗肝纤维化的机制及新药研究，本实验是其新药研究资料中主要药效学部分。研究了其对四氯化碳（carbon tetrachloride CCL4）致大鼠肝纤维化模型及酒精性肝纤维化大鼠模型抗肝纤维化的作用，并探讨了保肝宁对与肝纤维化发生、发展关系密切的两个因子——转化生长因子β1（transforming growth factorβ1 TGFβ1）、基质金属蛋白酶组织抑制因-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1 TIMP-1）的作用。为研究肝纤维化的病因、发病机制、筛选有效的抗肝纤维化药物等，国内外学者构建了一系列肝纤维化动物模型。目前应用较广泛的有化学性肝纤维化、免疫性肝纤维化、酒精性肝纤维化、胆总管结扎致肝纤维化、营养性肝纤维化、血吸虫性肝纤维化等动物模型。本研究中选用四氯化碳（carbon tetrachloride CCL4）致大鼠肝纤维化模型，因用CCL4攻击建立的肝纤维化模型，具有简便、易行、成本低、周期短等特点，在形态学、病理生理学的某些方面与人肝纤维化相似。选用酒精性肝纤维化大鼠模型，因酒精致大鼠肝纤维化模型，具有复制方法简单，稳定可靠，造模成功率高等特点，适用于酒精性肝病的研究。研究目的探讨保肝宁颗粒剂抗肝纤维化（liver fibrosis LF）的药效，并从转化生长因子β1（transforming growth factorβ1 TGFβ1）、基质金属蛋白酶组织抑制因-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1 TIMP-1）的角度探讨其抗肝纤维化的作用机理。研究方法一、建立四氯化碳（carbon tetrachloride CCL4）复合因素致肝纤维化大鼠模型：SPF级SD大鼠56只，雌雄各半，随机分为7组，每组8只，分别为：正常对照组、肝纤维化模型组（以下简称：模型组）、保肝宁高、中、低剂量组、秋水仙碱组、复方鳖甲软肝组（以下简称：复方鳖甲组）。肝纤维化模型组及药物组大鼠上午皮下注射40％四氯化碳花生油（第1次0.5ml／100g体质量，后每隔3日皮下0.3ml／100g体质量），下午药物组予相应药物，模型组予生理盐水灌胃（每日1次，每次1ml／100g体质量）。模型及给药组均给予高脂饮食（79.5％玉米粉+20％猪油+0.5％胆固醇），正常组予正常饮食，实验共进行6周。实验期满，取肝脏组织，HE及Mallory三色染色，光镜下观察肝组织细胞的病理改变及肝脏纤维的增生程度；取动物血清上层，AU5400全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶（glutamate-pyruvate transaminase ALT）、谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase AST）；用放免法测定血清透明质酸（hyaluronic acid HA）、层粘连蛋白（laminin LN）、Ⅲ型前胶原（precollagen typeⅢPCⅢ）、Ⅳ型胶原（collagen typeⅣCⅣ）；用ELISA法测定血清转化生长因子β1（transforming growth factorβ1 TGFβ1）、基质金属蛋白酶组织抑制因-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1 TIMP-1）。二、建立酒精（alcohol ALC）致肝纤维化大鼠模型：SPF级SD大鼠56只，雌雄各半，随机分为7组，每组8只，分别为：正常对照组、肝纤维化模型组、保肝宁高、中、低剂量组、秋水仙碱组、复方鳖甲软肝组。肝纤维化模型组及药物组，上午：予56°白酒“二锅头”灌胃（每日1次，每次0.5ml／100体质量）；下午：药物组予相应药物，模型组予生理盐水灌胃（每日1次，每次1ml／100体质量），且每晚八点后禁食至第二天上午空腹灌胃后再予饲料；正常对照组予等量的生理盐水做对照。模型及药物组予营养缺乏饲料（40％面粉+20％次粉+20％草粉+20％豆粉+少量豆油食盐），正常组予正常饲料，共90d。实验期满，取肝脏组织，HE及Mallory三色染色，光镜下观察肝组织细胞的病理改变及肝脏纤维的增生程度；取动物血清上层，AU5400全自动生化分析仪测定血清ALT、AST；用放免法测定血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ；用ELISA法测定血清TGFβ1和TIMP-1。研究结果一、保肝宁对四氯化碳（carbon tetrachloride CCL4）复合因素致大鼠肝纤维化模型的作用：1、与正常组动物血清相比，模型组动物血清中的ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ、TGFβ1、TIMP-1显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，保肝宁高、中、低剂量组血清中的ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ、TGFβ1、TIMP-1显著降低（P＜0.05）；秋水仙碱组、复方鳖甲软肝组动物血清中上述指标呈不同程度的下降趋势。2、在肝组织的HE和Mallory三色染色的病理图片中，模型组大鼠肝细胞呈弥漫的脂肪变性，肝组织内纤维组织（fibrous tissue FT）明显增生并形成纤维间隔分割肝小叶为假小叶结构，且纤维间隔内有散在炎症细胞（inflammatory cell IC）浸润，保肝宁组大鼠肝细胞内可见散在的脂肪变性，肝小叶结构不清楚，肝组织内有少量纤维组织增生或增生不明显。二、保肝宁对酒精（alcohol ALC）致大鼠肝纤维化模型的作用：1、与正常组动物血清相比，模型组动物血清中的ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ、TGFβ1、TIMP-1显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，保肝宁高、中、低剂量组血清中的ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ、TGFβ1、TIMP-1显著降低（P＜0.05）；秋水仙碱组、复方鳖甲软肝组动物血清中上述指标呈不同程度的下降趋势。2、在肝组织的HE和Mallory三色染色的病理图片中，模型组大鼠的肝细胞形态不规则，大部分呈气球样变，肝组织内纤维组织（fibrous tissue FT）明显增生并形成纤维间隔分割肝小叶为假小叶结构，且纤维间隔内有散在炎症细胞（inflammatory cell IC）浸润，保肝宁组大鼠的肝细胞部分排列紊乱，呈气球样变。肝组织内有少量纤维组织增生或增生不明显。研究结论研究表明，①保肝宁对四氯化碳致大鼠肝纤维化模型具有较好的抗肝纤维化作用。保肝宁可显著降低动物血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ、ALT、AST、TGFβ1、TIMP-1的水平；保肝宁药物组大鼠肝组织内纤维组织增生及炎性细胞浸润较模型组显著减少。②保肝宁对酒精致大鼠肝纤维化模型具有较好的抗肝纤维化作用。保肝宁可显著降低动物血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ、ALT、AST、TGFβ1、TIMP-1的水平；保肝宁药物组大鼠肝组织内纤维组织增生及炎性细胞浸润较模型组显著减少。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 1.1 中医药学对肝纤维化的认识
• 1.1.1 病因病机
• 1.1.2 药物治疗
• 1.2 现代医学对肝纤维化的认识
• 1.2.1 病因
• 1.2.2 发病机制
• 1.2.3 诊断
• 1.2.4 治疗
• 1.3 保肝宁的研究现状
• 第二部分 实验研究
• 2.1 保肝宁对四氯化碳致大鼠肝纤维化模型的拮抗作用研究
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.3 结果
• 2.1.4 讨论
• 2.2 保肝宁对酒精致大鼠肝纤维化模型的拮抗作用研究
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.2.3 结果
• 2.2.4 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间成果
• 致谢