人类Pin1在食管癌组织中的表达

论文摘要

蛋白质激酶Ser/Thr—Pro保守序列中Ser/Thr的可逆磷酸化,是细胞各种生命活动的重要信号调控机制,其失调将导致各种人类疾病的发生。Pin1是人类高度保守的特异性磷酸化肽基脯氨酰异构酶,它作用于脯氨酸所形成的肽键,并且仅使磷酸化pSer/Thr—Pro发生异构化,即由顺式变为反式,从而影响底物蛋白的功能。这一磷酸化后调控机制能诱导磷酸蛋白的构像变化,使其发挥功能。近来的研究显示这种新的调控机制在许多生理过程中起重要的调节作用,一旦失调便导致一系列人类疾病。如癌症病人体内Pin1表达异常增高,并调控多种癌基因的信号通路;而在神经退行性AD病人体内Pin1的表达量却明显下调,同时,Pin1缺失转基因鼠表现出与年龄相关的神经退化本文构建了pET42a+/Pin1质粒和pET28b+/Pin1质粒,寻找利用不同载体,在大肠杆菌中大量表达Pin1蛋白的最佳条件。进而通过各种不同的分离纯化方案,寻找最佳的蛋白分离纯化条件。将纯化出来的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗血清,得到效价较高的多克隆抗血清。并且利用免疫组织化学方法检测食管癌组织和正常食管组织中Pin1蛋白在翻译水平的表达差异;用实时定量PCR方法检测食管癌组织和正常食管组织中mRNA水平上的表达差异。结果显示,在蛋白质水平上,Pin1的表达在正常/癌两种不同的食管组织中,表达量存在着显著差异;而在mRNA水平上,Pin1的表达量在正常/癌两种不同的食管组织中,没有显著差异。这表明了Pin1在食管癌组织中的表达,可能是在翻译水平受到了调控;我们的研究进一步证实:Pin1在食管癌组织中存在蛋白水平的过量表达,这对利用Pin1作为食管癌组织检测标志物提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 人类Pin1基因及蛋白质结构与功能
• 1.2 Pin1与癌症的关系以及机理
• 1.3 人类食管癌
• 1.4 本课题的研究目的与意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验流程
• 2.3 试验原理和方法
• 3 结果与分析
• 3.1 分子克隆与质粒的构建
• 3.2 蛋白的表达及其分离纯化
• 3.3 圆二色谱测定蛋白的二级结构组成
• 3.4 多克隆抗血清的制备及其ELISA效价的测定
• 3.5 免疫组化测定Pin1在食癌组织中的表达量
• 3.6 Pin1在食管癌组织和正常食管组织中mRNA水平的表达
• 4 讨论
• 4.1 质粒的构建和蛋白纯化
• 4.2 Pin1在食管癌组织中表达的意义
• 4.3 Pin1在蛋白水平表达量和mRNA水平表达量的差异
• 参考文献
• 已接收的研究论文
• 致谢