大鼠弥漫性轴索损伤神经元、轴索继发性改变的实验观察

论文摘要

目的:弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury,DAI）亦称弥漫性白质损伤,是头部遭受特殊外力作用后,在剪应力作用下引起的以白质的广泛变性为主要特征的一种脑损伤。DAI可单独发生,也可伴发各种颅脑损伤,是颅脑损伤中最常见的致命性损伤。DAI是颅脑损伤后出现无血肿性持续昏迷、严重神经功能障碍和植物生存的最常见原因,致残率和致死率高,是法医学研究的重点和难点课题之一。大部分DAI的肉眼改变极其微小,很难通过死后尸检的肉眼改变进行诊断,只能通过微观的形态学验证。弥漫性脑白质尤其是在胼胝体和脑干部位的神经纤维的形态学改变是诊断DAI的主要病理学依据。本实验通过参照1994年Marmarou A等的方法建立大鼠弥漫性轴索损伤模型,并观察中枢神经系统神经元胞体和轴索发生的继发性病理改变,进一步探讨弥漫性轴索损伤的病理机制,以期为法医病理学和法医临床学鉴定提供实验依据。方法:Sprague-Dawley大鼠（体重: 383±26克）随机分为12组:正常对照组、手术对照组、损伤组;损伤组包括打击后不同时相组:0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d。参照Marmarous A等的方法制备大鼠脑弥漫性轴索损伤模型:称重后水合氯醛麻醉大鼠,达到一定麻醉深度后沿顶部正中线切开头皮,分离皮下组织、骨膜,暴露冠状缝和人字缝之间颅骨,将一直径为10mm、厚3mm的不锈钢垫片固定于颅骨顶部冠状缝和人字缝中间位置,缝合多余手术切口。次日,乙醚麻醉大鼠,将其俯卧固定于致伤装置的树脂盒内的海绵床上（12×12×43cm）,保证大鼠头部位置端正,并使垫片的中央正对致伤装置有机玻璃管的下口。重锤（铜质,450g）从指定的高处（2m）自由下落至圆盘形的垫片上,海绵床连同大鼠要在打击后迅速撤离有机玻璃管下方防止二次打击。随后将大鼠转移至操作台上检查疼痛反射及有无颅骨骨折。正常对照组大鼠不作任何处理;手术对照组大鼠给予手术及打击前处理,但不予打击;损伤组按上述方法给予打击,根据打击后不同时间处死。大鼠麻醉后全身灌注固定取全脑,制作石蜡切片,采用HE染色、硫瑾染色、Gless嗜银染色和免疫组织化学的方法观察损伤的神经元胞体和轴索形态学改变,并用TUNEL法检测神经元的DNA损伤情况。数据采用均数士标准差（Mean士SD）表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA）,用最小显著差法（LSD）作两两比较,以p<0.05为有显著性差异。结果:1损伤组大鼠打击后即刻出现昏迷和呼吸暂停（≤20s）,平均昏迷时间为6.90±2.48min。根据大鼠行为学评分标准损伤组大鼠各项指标均伴有不同程度的下降,平均分数为6.5±2.05。2手术对照组和正常对照组相比无明显改变;损伤后早期海马、皮层和脑干等部位神经元肿胀,体积增大,核膜不清,核仁深染偏位或消失,并可见到深染的粉红色固缩神经元。24h粉红色固缩神经元数目明显增多,神经细胞周围出现空隙,核固缩,胞质和胞核黏附（称为暗细胞）,7d组仍可见少量暗细胞存在。3硫瑾染色结果:神经元尼氏小体从核周开始崩解呈尘状颗粒,并逐渐向外扩展,进而完全溶解消失。损伤后3h大脑皮层和海马开始出现阳性细胞的增多,至伤后48h达到高峰,伤后7d阳性细胞数仍高于正常对照组和手术对照组（p<0.05）。4 GLESS氏嗜银染色结果:正常对照组和手术对照组脑组织结构清晰,神经纤维排列整齐,表面光滑。损伤组脑组织早期无明显改变,打击后12h胼胝体和脑干部位神经轴索呈现扭曲、肿胀、波浪状改变和轴索收缩球形成,24h及48h变化更加明显,72h以后受损轴索数目减少,呈恢复期改变。5β-APP的免疫组织化学染色结果:正常对照组和手术对照组轴索无阳性表达。损伤组于打击后1h可见轴索β-APP阳性表达增高,胼胝体和脑干部位出现大量呈肿胀、波浪状改变的轴索以及轴索收缩球。24h及48h的β-APP表达量达到峰值,受损轴索直径增大,72h以后受损轴索数目减少,7d组与对照组比较无明显差异（p>0.05）。6 TUNEL法检测细胞凋亡结果:正常对照组、手术对照组以及损伤后0h、1h、3h组仅发现个别染色阳性细胞,损伤后6h染色阳性细胞数目开始增多,海马凋亡细胞数在损伤后24h到达高峰,大脑皮层48h凋亡达到高峰,损伤后7d大脑皮层仍有大量阳性细胞表达,与对照组相比有显著性差异（p<0.05）。结论:1本实验成功建立了大鼠DAI模型,制作简便,重复性好,结果可靠,可用于DAI的基础研究。2DAI是一个渐进的过程,随着时间的推移,呈现受损轴索数目和直径的变化。3 DAI引起迟发性的神经元变性、死亡,以凋亡为主,持续时间较长。

论文目录

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• 研究论文 大鼠弥漫性轴索损伤神经元、轴索继发性改变的实验观察
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 关于弥漫性轴索损伤的研究进展
• 致谢
• 个人简历