Caco-2细胞中葡萄糖、中性氨基酸和二肽（Lys-Phe）转运载体基因和蛋白表达对底物反应模式的比较研究

论文摘要

本试验就是在mRNA和蛋白水平上，通过比较三种转运载体（葡萄糖、中性氨基酸、二肽）对底物的反应模式，评估小肽吸收是否具有营养学意义。试验一：选用人的结肠癌细胞（Caco-2细胞）作为小肠营养底物转运的体外模型，观察饥饿条件下，不同时间点（共20个时间点）肽转运载体PepT1mRNA的表达水平，共分20个处理组，每组六个重复。设零时刻为对照组，对照组和各处理组分别对Caco-2细胞进行总RNA的提取，检测PepT1mRNA的表达。结果表明，时间与PepT1mRNA相对表达水平线性回归得到二次函数：y=-0.000382t2+0.0112t+0.8284（t：时间，y：PepT1mRNA相对表达水平），相关系数r=0.62。当t=15h时，Pept1mRNA表达量最高;短时间的饥饿能够引起PepT1mRNA的表达水平显著上调（P<0.05），随着时间的延长PepT1mRNA的表达水平逐渐下降。分析可能是细胞为了平衡肽供应的短缺而短时间内发生暂时代偿性的变化，即增加Caco-2细胞内Pept1mRNA水平，从而保证小肽载体的数量，使小肽的吸收不致减少，这可能是Caco-2细胞对环境适应的一种生理反应。试验二：本试验同样选用人的肠道癌细胞（Caco-2细胞）作为小肠营养底物转运的体外模型。三个试验：1、Caco-2细胞饥饿2h后添加25mmol/L的葡萄糖，PT-PCR检测SGLT1mRNA在不同时间点的相对表达量；2、Caco-2细胞饥饿2h后添加0.8mmol/L的二肽（Lys-Phe），PT-PCR检测PepT1mRNA在不同时间点的相对表达量；3、Caco-2细胞饥饿2h后添加0.8mmol/L的中性氨基酸（Ser、Thr、Cys、Ala），PT-PCR检测ASCT2mRNA在不同时间点的相对表达量；每个试验分为9个处理组，每组六个重复。结果发现，葡萄糖转运载体SGLT1mRNA在第15min时显著上调（P<0.05），随时间的延长SGLT1mRNA表达逐渐下调，24h时SGLT1mRNA相对表达量低于对照组但不显著（P>0.05）；中性氨基酸转运载体ASCT2mRNA在第15min、30min时表达显著上调（P<0.05），15min、30min ASCT2mRNA表达无差异（P>0.05），而后随时间延长呈现逐渐下降的趋势，24h时ASCT2mRNA表达显著低于对照组（P<0.05）；小肽转运载体PepT1mRNA的水平随着时间呈现波浪下降的趋势，且在第10min、30min、120min、24hPepT1mRNA的表达最高，与对照组相比差异显著（P<0.05）。结果表明：Caco-2细胞饥饿2h后添加底物均能够在短时间内增加相应转运载体mRNA的表达，进而通过增加转运载体的数量来转运底物，随着时间的延长转运载体蛋白可能处于一种动态平衡，再反过来调节载体mRNA的表达。固定底物浓度，三种转运载体mRNA对时间的反应模式基本一致。试验三：本试验从mRNA和蛋白两个水平来研究不同浓度的底物对相应转运载体表达的影响，Caco-2细胞作为体外营养转运的模型。三个试验分别是Caco-2细胞饥饿2h后添加不同浓度的底物，孵育24h后提取总RNA和蛋白，检测相应转运载体的表达，分别有6个处理组，每个处理6个重复。结果发现，对照组各转运载体mRNA的表达水平均高于各处理组（P<0.05），底物浓度梯度增加对各自转运载体mRNA的表达均无显著影响（P>0.05）。葡萄糖浓度梯度增加能够上调SGLT1蛋白表达水平（P<0.05），但是50mmol/L、100mmol/L对SGLT1蛋白水平无显著影响（P>0.05）；二肽（Lys-Phe）和中性氨基酸（Ser、Thr、Cys、Ala）浓度梯度增加对各自转运载体蛋白表达无影响仅有上升的趋势（P>0.05）。上述结果表明，在本试验浓度范围条件下，三种转运载体基因和蛋白水平受底物浓度影响不大，但是饥饿却均能显著促进各转运载体mRNA水平的表达，分析可能是转运载体蛋白在mRNA合成和蛋白降解中维持着一个动态平衡；与葡萄糖、中性氨基酸结果相比，底物肽对肽转运载体的影响与前两者所观察的表象基本一致，由此，对于肽在动物体内的营养学意义我们持正面支持的观点。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 小肽营养的研究进展
• 1.1.1 小肽的吸收机制与特点
• 1.1.2 小肽的营养作用
• 1.1.3 小肽转运载体的研究进展
• 1.2 葡萄糖、中性氨基酸转运载体的活性调控
• 1.2.1 葡萄糖转运载体 SGLT1 的活性调控
• 1.2.2 中性氨基酸转运载体 ASCT2 的活性调控
• 1.3 小肽吸收的营养学意义的研究进展
• 1.3.1 小肽吸收的研究进展
• 1.3.2 小肠营养吸收的研究方法
• 1.4 研究小肽吸收的营养学意义
• 1.4.1 与蛋白质营养体系的关系
• 1.4.2 与奶牛日常生产的关系
• 1.5 本课题研究的目的
• 2 材料与方法
• 2.1 Caco-2 细胞培养与 Caco-2 细胞中 PepT1mRNA 对饥饿时间的反应模式
• 2.1.1 试验设计
• 2.1.2 试验材料与试剂
• 2.1.3 试验方法
• 2.2 固定底物浓度， Caco-2 细胞中三种转运载体对时间的基因反应模式
• 2.2.1 试验设计
• 2.2.2 试验材料与试剂
• 2.2.3 Caco-2 细胞中各转运载体基因指标的测定
• 2.3 三种转运载体基因和蛋白水平对底物的反应模式
• 2.3.1 试验设计
• 2.3.2 试验材料与试剂
• 2.3.3 试验方法
• 3 结果分析
• 3.1 Caco-2 细胞中 PepT1mRNA 对饥饿时间的反应模式
• 3.2 固定底物浓度， Caco-2 细胞中三种转运载体对时间的基因反应模式
• 3.2.1 葡萄糖（D-Glcuose）
• 3.2.2 中性氨基酸（Ser、Thr、Cys、Ala）
• 3.2.3 二肽（Lys-Phe）
• 3.3 Caco-2 细胞中三种转运载体基因和蛋白水平对各自底物的反应模式
• 3.3.1 基因水平对底物的反应模式
• 3.3.2 蛋白水平对底物的反应模式
• 4 讨论
• 4.1 Caco-2 细胞中 PepT1mRNA 对饥饿时间的反应模式
• 4.2 固定底物浓度， Caco-2 细胞中三种转运载体对底物的基因反应模式
• 4.3 Caco-2 细胞中三种转运载体基因和蛋白表达对各自底物的反应模式
• 5 全文结论与研究进展
• 5.1 结论
• 5.2 课题创新和研究展望
• 5.2.1 课题创新
• 5.2.2 研究展望
• 参考文献
• 致谢