苄嘧磺隆降解菌的分离鉴定特性研究及生态学研究

论文摘要

本论文主要以浙江大学华家池校区农场淹水稻田土壤为研究材料,以我国水稻田中广泛使用的磺酰脲类除草剂苄嘧磺隆为主要研究对象,筛选分离到几株苄嘧磺隆降解菌株,并对降解菌株的生长及降解特性进行了初步探讨:综合运用传统培养方法及现代分子生物学手段,采用室内培养、纯培养及统计分析相结合的方法,全面探讨了磺酰脲类除草剂苄嘧磺隆对淹水稻田土壤可培养微生物种群数量、土壤酶活性、土壤呼吸以及微生物生态的毒性效应,为建立有效的除草剂污染预警指标体系、环境质量评价及苄嘧磺隆降解菌株的有效利用提供了有益参考。本研究主要结果如下:1、从供试土样中共分离纯化得到4株苄嘧磺隆降解效率较高的菌株,将其中1株降解效率最高的苄嘧磺隆降解菌株编号为D5。经形态观察、生理生化分析、G+C mol%、16S rDNA序列同源性比较和Biolog碳源利用分析,初步鉴定该菌株为巨大芽孢杆菌菌株（Bacillusmegaterium）。其它3株苄嘧磺隆降解菌株A2、B2和D2分别与三氯乙烯降解菌株Rhodococcus sp.L4、类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis IFO 12334T和苯胺降解菌株Rhodococcus sp.AN-22的相似度最高,分别达到99.7%、100%和100%。菌株D5能较好利用苄嘧磺隆、绿磺隆、氯嘧磺隆和嘧磺隆等四种磺酰脲类除草剂;能很好利用苯、蒽酮、三唑磷、敌敌畏和乐果;可以利用二甲苯、硝基苯、对苯二胺、间苯二酚、邻苯二酚、苯酚、敌百虫、毒死蜱和喹硫磷;不能利用萘、甲苯和十溴联苯醚。可见,D5既可以利用磺酰脲类除草剂,又可以利用有机磷农药和部分芳香族化合物。可为多功能菌（菌群）的研究提供良好材料,有一定的研究价值。抗敏性结果表明,菌株D5对设定浓度范围内的所有供试抗生素都很敏感,对青霉素钠、氨苄青霉素、先锋霉素Ⅴ和Ⅵ尤为敏感,均产生较大的抑菌圈。苄嘧磺隆降解菌株D5在pH 6.5-9的范围内均可以生长,以在pH 7.5时生长最佳;菌株D5在10-40℃的温度范围内均可以生长,30℃是最佳生长温度;苄嘧磺隆浓度对菌株D5的生长有一定的影响,50 mg L-1时菌株D5生长最好;装液量为25-150 ml（250 ml三角瓶）,菌株D5均可以生长,通气量为1/5体积时菌株生长状况最好;Mg2+浓度为100-500 mg L-1的范围内,菌株均可以生长,以Mg2+浓度为400 mg L-1时菌株D5的生长最佳。分别以酵母膏为唯一碳源和以葡萄糖为唯一氮源时,菌株D5生长最好。菌株D5纯培养和四株降解菌株混培对整体生物量的影响不同。pH 7.5和30℃时,苄嘧磺隆降解效果最好。液体培养基中84h苄嘧磺隆的降解达到97.7%。说明菌株D5具有较好的降解能力。对添加降解菌株D5以及D5和BH混合菌剂后的苄嘧磺隆降解动力学进行研究发现:整个取样过程中,不同浓度的苄嘧磺隆均有一定程度的降解,降解情况取决于施用的苄嘧磺隆浓度。降解菌剂的加入对苄嘧磺隆在淹水稻田土壤中的降解有一定的促进作用,以只加降解菌株D5菌剂的降解效果为佳。模拟田间淹水稻田土壤中42 d时,苄嘧磺隆的降解达到94.3%,其中微生物降解达到32.5%,而试验过程中降解菌株细胞数量基本保持稳定,未发现其它污染微生物的存在,说明菌株D5在整个降解过程中起到积极作用。进一步证明了淹水稻田土样中利用微生物对苄嘧磺隆污染土壤进行生物修复的可能性。混合菌剂对四种除草剂均有较好的降解效果。苄嘧磺隆诱导后的菌株全细胞蛋白电泳显示出特异性条带,说明该条带可能是与苄嘧磺隆的降解或解毒有关的蛋白。紫外诱变方法筛选到降解特性可以稳定遗传的突变体6。2、采用传统培养方法研究不同浓度苄嘧磺隆的施用对淹水稻田土壤可培养微生物（好氧细菌、真菌、放线菌、固氮细菌、氨化细菌、纤维素分解菌、硫化细菌以及厌氧固氮细菌和反硫化细菌）种群数量、土壤呼吸和土壤酶（过氧化氢酶、蔗糖酶、脲酶和多酚氧化酶）活性的影响。结果表明:恒温培养条件下,不同浓度苄嘧磺隆的施用对淹水稻田土壤微生物种群数量、土壤呼吸强度和土壤酶活性有不同影响。苄嘧磺隆的施用能够影响淹水稻田土壤可培养微生物的生长,影响程度取决于苄嘧磺隆的施用剂量。低浓度苄嘧磺隆显著刺激纤维素分解菌和硫化细菌的生长（P＜0.05;P＜0.05）。14 d时,0.067和0.335μg g-1干土的苄嘧磺隆处理土样中的放线菌数量显著高于对照水平;7 d和14 d时,0.067和0.335μg g-1干土的苄嘧磺隆处理土样中氨化细菌数量显著高于对照水平;21d和28d下降到低于对照水平。高剂量(3.553μg g-1干土)的苄嘧磺隆对好氧异养细菌（AHB）、放线菌、好氧固氮菌、氨化细菌和纤维素分解菌的生长均有强烈的抑制作用。尽管苄嘧磺隆在培养初期对处理土样中的可培养微生物的生长有一定的影响作用,但是,除AHB和好氧纤维素分解菌外,这种影响都不是持久性的。因此,低剂量苄嘧磺隆对土壤可培养微生物种群安全,而高剂量的苄嘧磺隆对土壤可培养微生物种群数量有一定的消极影响。苄嘧磺隆施用初期能刺激土壤呼吸强度,随后产生轻微的抑制作用,这种抑制作用在取样后期逐渐减轻并趋于对照水平。苄嘧磺隆能轻微刺激过氧化氢酶活性,而蔗糖酶活性基本不受苄嘧磺隆施用量的影响,脲酶活性则是先刺激后抑制,多酚氧化酶活性受苄嘧磺隆影响不大。说明施用一定量的苄嘧磺隆对淹水稻田土壤生态环境是安全的。3、在传统微生物污染生态研究基础上,运用现代分子生态学手段,获得可用于高效扩增16S rDNA的V3可变区的直接提取的高质量土壤总DNA,并采用DGGE分子指纹技术,对苄嘧磺隆污染条件下淹水稻田土壤微生物群落结构变化进行了初步探讨。通过DGGE图谱分析发现,苄嘧磺隆的施用对淹水稻田土壤微生物种群结构有一定的影响,处理第4周,这种影响有所减弱,对照土样和苄嘧磺隆处理土样中微生物群落多样性差异较小;处理第5周,对照土样和苄嘧磺隆处理土样中微生物群落多样性差异进一步减小,几乎相同。从处理1-5周土样的DGGE图谱中还可以发现,低浓度苄嘧磺隆处理土样中微生物群落结构之间差异较小,可近似认为低浓度苄嘧磺隆对淹水稻田土壤微生物是安全的,这与前面两章对土壤可培养微生物和土壤酶活性以及土壤呼吸的研究所得出的结论一致。苄嘧磺隆是一种相对比较安全的除草剂,可以大力推广在田间使用。苄嘧磺隆降解菌D5菌剂的添加能够缓解苄嘧磺隆的负面效应,刺激其它细菌的生长,使土样微生物基因多样性提高。处理土样中,不同取样时间微生物群落结构之间存在着显著的差异:不同取样时间DGGE电泳条带有增有减,特征条带（敏感微生物）亮度很强。本研究是一个新的尝试,即添加苄嘧磺隆降解菌株来修复苄嘧磺隆污染的土壤。4、以大肠杆菌（Escherichia coli）K12、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B19等土壤典型微生物及苄嘧磺隆降解菌（Bacillus megaterium）D5为试验材料,通过对土壤典型微生物和苄嘧磺隆降解菌株的生长、活性、应激反应以及生化指标方面的影响研究,初步探讨了苄嘧磺隆胁迫对微生物纯培养的生理毒性。结果如下:加入不同浓度苄嘧磺隆的培养基中,两种G+细菌和一种G-细菌均表现出SOD、CAT和ATPase的活性。说明苄嘧磺隆对三种供试细菌均有一定程度的诱导作用。但对苄嘧磺隆降解菌株D5的诱导作用弱于其他2种非苄嘧磺隆降解菌株,这可能与降解菌株D5能降解苄嘧磺隆有关。SOD和CAT活性的增加是机体对抗氧化胁迫的一种适应性变化,而ATPase在细菌抗氧化胁迫过程中也发生一系列变化,从而使得将微生物体内SOD、CAT和ATPase活性作为环境受到污染胁迫的分子指标具有一定可行性。活性染色条带的变化可能是由于菌株SOD的表达量不同或苄嘧磺隆对SOD的组成产生了某种影响。有关结论需要进一步试验才能证明。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 农药工业概况
• 1.1.1 我国农药工业概况
• 1.1.2 我国除草剂工业概况
• 1.1.3 磺酰脲类除草剂的发展
• 1.1.4 苄嘧磺隆的应用及研究进展
• 1.2 除草剂对土壤环境的影响
• 1.2.1 除草剂在土壤环境中的行为
• 1.2.2 农药对土壤微生物的影响
• 1.3 土壤微生物生态的研究方法及最新研究进展
• 1.3.1 土壤微生物群落结构的概念
• 1.3.2 土壤微生物群落结构的研究方法
• 1.4 农药在土壤中的降解转化及其污染土壤的生物修复
• 1.4.1 农药在土壤中的降解转化
• 1.4.2 农药残留的检测方法
• 1.4.3 农药污染土壤的生物修复
• 第二章 苄嘧磺隆降解菌株的分离及鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 土壤样品与试剂
• 2.2.2 药品
• 2.2.3 主要试验仪器
• 2.2.4 主要培养基组成
• 2.2.5 降解菌的富集、分离和纯化
• 2.2.6 降解菌株的形态、生理生化特性
• 2.2.7 降解菌株的BIOLOG-GP鉴定
• 2.2.8 降解菌株的G+C mol%测定
• 2.2.9 降解菌株的16S rDNA PCR扩增、序列测定及系统发育分析
• 2.2.10 抗生素敏感性试验
• 2.2.11 底物降解广谱性试验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 降解菌的富集、分离和纯化
• 2.3.2 降解菌株的形态、生理生化特性
• 2.3.3 降解菌株D5的G+C mol%测定
• 2.3.4 降解菌株16S rDNA的PCR扩增、序列测定及系统发育分析
• 2.3.5 抗生素敏感性试验
• 2.3.6 底物降解广谱性试验
• 2.4 本章小结
• 第三章 苄嘧磺隆降解菌的生长、降解特性研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 供试菌和药品
• 3.2.2 降解菌株D5的生长研究
• 3.2.3 降解菌株D5降解特性的研究
• 3.2.4 降解菌株D5在液体培养基中的降解
• 3.2.5 种群多样性试验中苄嘧磺隆降解的测定
• 3.2.6 苄嘧磺隆降解菌株混培对苄嘧磺隆、嘧磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆的影响
• 3.2.7 苄嘧磺隆诱导对D5菌株全细胞蛋白组成的影响
• 3.2.8 降解菌株D5质粒的提取
• 3.2.9 降解菌株D5质粒消除试验设计
• 3.2.10 降解菌株D5的紫外诱变
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 降解菌株D5的生长研究
• 3.3.2 降解菌株D5的降解特性
• 3.3.3 降解菌株D5在液体培养基和模拟田间淹水稻田土壤中的降解
• 3.3.4 四株苄嘧磺隆降解菌混培养对四种磺酰脲类除草剂的降解
• 3.3.5 苄嘧磺隆诱导对D5菌株全细胞蛋白组成的影响
• 3.3.6 降解菌株D5质粒的提取
• 3.3.7 降解菌株D5质粒消除
• 3.3.8 降解菌株D5的紫外诱变
• 3.4 本章小结
• 第四章 苄嘧磺隆对淹水稻田土壤可培养微生物种群数量的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 供试土壤
• 4.2.2 供试农药
• 4.2.3 试验设计
• 4.2.4 培养基配方和计数方法
• 4.2.5 数据分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 苄嘧磺隆对淹水稻田可培养好氧微生物种群数量的影响
• 4.3.2 苄嘧磺隆对淹水稻田可培养厌氧微生物种群数量的影响
• 4.4 本章小结
• 第五章 苄嘧磺隆对淹水稻田土壤呼吸和土壤酶活性的影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 供试土壤
• 5.2.2 供试农药
• 5.2.3 试验设计
• 5.2.4 土壤呼吸强度测定
• 5.2.5 各种土壤酶活性的测定
• 5.2.6 数据分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 苄嘧磺隆对淹水稻田土壤呼吸作用的影响
• 5.3.2 苄嘧磺隆对淹水稻田土壤过氧化氢酶的影响
• 5.3.3 苄嘧磺隆对淹水稻田土壤蔗糖酶活性的影响
• 5.3.4 苄嘧磺隆对淹水稻田土壤脲酶活性的影响
• 5.3.5 苄嘧磺隆对淹水稻田土壤多酚氧化酶活性的影响
• 5.4 本章小结
• 第六章 苄嘧磺隆对淹水稻田土壤微生物种群变化的DGGE分子指纹图谱分析
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 供试土壤和菌株
• 6.2.2 试验仪器及药品
• 6.2.3 试验设计与实施
• 6.2.4 土样总DNA的提取
• 6.2.5 DNA的定量和纯度检测
• 6.2.6 PCR扩增
• 6.2.7 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 6.2.8 染色
• 6.2.9 割胶回收
• 6.2.10 指纹图谱分析
• 6.2.11 克隆和序列分析
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 土壤总DNA提取结果
• 6.3.2 特异性引物的PCR扩增
• 6.3.3 苄嘧磺隆处理对淹水稻田土壤微生物群落结构的影响
• 6.3.4 特异性条带的克隆与序列分析
• 6.4 本章小结
• 第七章 三种纯种细菌对苄嘧磺隆胁迫的氧化应激反应研究
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 仪器及试剂
• 7.2.2 供试菌种
• 7.2.3 培养基
• 7.2.4 试验设计
• 7.2.5 数据分析
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 不同浓度苄嘧磺隆对菌株SOD活性的影响
• 7.3.2 不同浓度苄嘧磺隆对菌株CAT活性的影响
• 7.3.3 不同浓度苄嘧磺隆对菌株ATPase活性的影响
• 7.3.4 苄嘧磺隆对培养24h的巨大芽孢杆菌D5、枯草芽孢杆菌B19和大肠杆菌K12 SOD活性和影响
• 7.3.5 苄嘧磺隆对巨大芽孢杆菌D5、桔草芽孢杆菌B19和大肠杆菌K12 CAT活性的影响
• 7.3.6 苄嘧磺隆对巨大芽孢杆菌D5、枯草芽孢杆菌B19和大肠杆菌K12 ATPase活性的影响
• 7.3.7 PAGE电泳及活性染色观察BSM对细菌SOD同工酶组成的影响
• 7.4 本章小结
• 论文结论与展望
• 1 全文主要研究结论
• 2 论文的创新之处
• 3 论文的不足之处与展望
• 参考文献
• 攻读博士期间论文发表及获奖情况