牛凝乳酶基因在黑曲霉中的表达研究

论文摘要

凝乳酶能引起蛋白质凝聚,导致牛奶凝结,因此在乳制品加工尤其是在奶酪加工中广泛应用。传统的生产方法是屠宰刚出生几天的小牛,从第四胃中提取凝乳酶。但是由于全球性的小牛短缺使得凝乳酶的来源受限,价格昂贵。并且微生物蛋白酶、植物蛋白酶和其他动物蛋白酶的替代效果都不理想。因此利用基因工程技术生产牛凝乳酶有重要的研究价值。丝状真菌中的曲霉具有遗传背景清楚、生长迅速、高水平地表达多种蛋白质,并将其蛋白质产物分泌至细胞外等优点。其中的黑曲霉是一种不产生黄曲霉毒素的安全真菌,除了在发酵工业上被广泛应用外,其在作为“真核蛋白工厂”方面也受到了很大重视。本研究以糖化酶工业生产菌种黑曲霉为受体材料,针对高表达的糖化酶基因位点,构建牛凝乳酶基因置换载体,采用多种方法对黑曲霉进行遗传转化。并在潮霉素基因两端设计了正向重复序列,使在后续的研究中消除抗性基因成为可能,从而为构建安全高效的牛凝乳酶黑曲霉工程菌奠定了基础。主要研究结果如下:1.基因与同源臂片段的克隆采用PCR扩增方法,分别获得牛凝乳酶基因Cym,黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5和下游基因片段Gla3、Gla3a。2.载体的构建运用重叠延伸PCR,将Gla5、Gla3与Cym基因拼接得到Gla5-Cym-Gla3片段。构建了接头载体pSZA,牛凝乳酶基因转化黑曲霉载体pEASY-CYM,农杆菌介导的牛凝乳酶基因同源重组转化黑曲霉载体pSZH-CYM,以及中间载体pEASY-hph、pAN-Gla3a。3.黑曲霉原生质体制备与再生条件的优化从培养基的选择、菌龄、酶的种类、酶解时间、渗透压稳定剂、酶解过程的处理等方面对黑曲霉原生质体制备与再生条件进行优化。结果表明选择固体PDA培养基、30℃以下0.4%的蜗牛酶、pH值为6.0的50mM的磷酸缓冲溶液、酶解过程使用50rpm,产生的原生质体量与再生率乘积最高。4.凝乳酶基因对黑曲霉的转化运用REMI法将质粒pEASY-CYM转化黑曲霉,经抗性筛选获得23个菌落。菌丝作为转化受体效率约9 cfu/μg DNA,原生质体作为转化受体效率约2 cfu/μgDNA。经PCR检测得到了5个转化子,以菌丝和原生质体为转化受体的PCR阳性率分别为14%和50%。5.牛凝乳酶基因在黑曲霉中的表达对牛凝乳酶基因转化黑曲霉的阳性转化子进行酶活测定,培养时间为6d时表达量最高,酶活为7.9SU/mL。6.农杆菌介导的遗传转化冻融法将pSZH-CYM置换载体转入农杆菌EHA105中。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 研究的目的及意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 凝乳酶研究进展
• 1.2.2 丝状真菌遗传转化系统研究进展
• 1.2.3 丝状真菌的原生质体技术
• 1.3 本论文的主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株及载体
• 2.1.2 试剂及酶类
• 2.1.3 常用试剂的配制
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要实验设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株的培养和菌种保存
• 2.2.2 基因组DNA 的提取
• 2.2.3 基因的扩增
• 2.2.4 载体的构建
• 2.2.5 黑曲霉原生质体的制备及再生
• 2.2.6 直接转化法对黑曲霉的遗传转化
• 2.2.7 农杆菌介导法对黑曲霉的遗传转化
• 2.2.8 转化子的PCR 检测
• 2.2.9 重组菌株凝乳酶活性测定
• 3 结果与分析
• 3.1 Cym 基因表达载体的构建
• 3.1.1 基因与同源臂的克隆
• 3.1.2 重叠延伸 PCR 拼接Gla5、Cym、Gla3 片段
• 3.1.3 pAN-Gla3a 载体的构建
• 3.1.4 pEASY-hph 载体的构建
• 3.1.5 pEASY-CYM 载体的构建
• 3.1.6 pSZA 接头载体的构建
• 3.1.7 pSZH-CYM 置换载体的构建
• 3.2 原生质体受体系统的建立
• 3.2.1 常规方法制备原生质体及原生质体再生
• 3.2.2 糖化酶生产菌种黑曲霉原生质体制备和再生条件的优化
• 3.3 直接转化法对黑曲霉的遗传转化
• 3.3.1 电击法转化黑曲霉
• 2/PEG 法转化黑曲霉'>3.3.2 CaCl₂/PEG 法转化黑曲霉
• 3.3.3 REMI 法转化黑曲霉
• 3.3.4 转化子的PCR 鉴定
• 3.3.5 重组菌株的酶活测定
• 3.4 农杆菌介导法对黑曲霉的遗传转化
• 3.4.1 pSZH-CYM 置换载体导入农杆菌
• 3.4.2 农杆菌介导法转化黑曲霉
• 4 讨论
• 4.1 农杆菌介导的黑曲霉转化载体的构建
• 4.2 原生质体制备与再生最优条件的确定标准
• 4.3 转化方法的问题
• 5 结论
• 5.1 基因的克隆
• 5.2 载体的构建
• 5.3 黑曲霉原生质体制备与再生条件的优化
• 5.4 牛凝乳酶基因对黑曲霉的转化
• 5.5 牛凝乳酶基因在黑曲霉中的表达
• 5.6 农杆菌介导的遗传转化
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文