姜黄素调控PI3K/AKT-Skp2-Cip/Kips通路诱导MCF-7，MDA-MB-231不同细胞毒性敏感性的分子机理研究

论文摘要

姜黄素是植物姜黄的一个主要成分。它的药理作用广泛,主要特征为抗氧化和抗炎症。近些年大量文献报道姜黄素有抗癌活性,它能够抑制多种肿瘤细胞的增殖,侵袭,血管生成以及细胞代谢。与此同时,不同肿瘤细胞对姜黄素又表现出不同的敏感性,然而对其背后的机理却研究得很少。本课题探讨姜黄素作用于MCF-7和MDA-MB-231二种不同乳腺癌细胞的分子机理,从而进一步了解姜黄素的作用机制以及姜黄素成为潜在抗肿瘤药物的可能性。WST-1细胞毒性试验,克隆群落试验,流式周期检测和caspase-3活性检测试验结果显示姜黄素对MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞均有抗增殖及致凋亡作用,而姜黄素对MDA-MB-231细胞毒性明显大于其对MCF-7细胞毒性。进一步研究发现,MCF-7和MDA-MB-231细胞对姜黄素呈现不同敏感性与细胞周期蛋白抑制蛋白Cip/Kips家族的p27和p21的激活相关,而与p57不相关。在MDA-MB-231细胞上,p27和p21的表达随姜黄素浓度及作用时问的递增而上调,而调控p27和p21降解的泛素化连接酶skp2则呈现随姜黄素浓度和时间梯度下调。在MCF-7细胞株中,仅当姜黄素浓度高且作用时间较长时,才出现显著的p27,p21上调以及skp2下调,40μM姜黄素作用MCF-7细胞3hr,6hr观察到skp2反而上调。结果提示,姜黄素在MCF-7和MDA-MB-231细胞上对skp2-Cip/Kips信号通路有不同的调控作用,而这种调控作用的差异与MCF-7和MDA-MB-231细胞对姜黄素毒性呈现敏感性差异有着密切关系。这在skp2RNA干扰（skp2-siRNA）的MCF-7以及MDA-MB-231细胞中得到了证实,即skp2RNA干扰后,这二种细胞的p27和p21明显上调,且skp2-siRNA和姜黄素联用显著提高了MCF-7细胞对姜黄素毒性的敏感性,细胞毒性与姜黄素诱导MDA-MB-231细胞毒性相当。Skp2-siRNA和姜黄素联用处理MDA-MB-231细胞有药物协同作用,诱导细胞毒性更大。为了解姜黄素作用下skp2-Cip/Kips的变化与其上游信号分子的作用关系,我们考察了作为skp2代谢的关键调控因子之一的AKT活性对姜黄素作用的响应。结果显示,姜黄素介导的AKT （ser473位点）磷酸化及其底物foxol及foxo3a磷酸化在MCF-7和MDA-MB-231细胞中呈相反的变化,提示PI3K/AKT信号通路也可能与姜黄素诱导的毒性敏感性差异存在重要作用关系。为确证姜黄素调控skp2与PI3K/AKT的作用关系,我们将wortmannin （PI3K特异性抑制剂）和姜黄素共同作用于耐药株MCF-7细胞,发现姜黄素引起的AKT磷酸化及其skp2上调都得到了逆转,提示姜黄素调控skp2的变化与AKT的磷酸化程度密切相关。使用wortmannin和姜黄素联合作用MCF-7细胞提高了MCF-7对姜黄素诱导细胞毒性的敏感性至姜黄素单独作用MDA-MB-231细胞毒性的水平。Wortmannin和姜黄素联用处理MDA-MB-231细胞有药物协同作用,联合用药诱导的MDA-MB-23细胞毒性更大综上所述,我们的结果揭示skp2是姜黄素作用乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞重要的分子靶标。姜黄素诱导的细胞毒性与PI3K-Skp2-Cip/Kips信号通路的抑制程度相关,提示P-AKT及其skp2在预测姜黄素用于乳腺癌治疗效果中是非常重要的药理学分子标记物。PI3K/AKT通路抑制剂以及skp2依赖的泛素蛋白酶降解途径抑制剂和姜黄素联合用药可能为其治疗乳腺癌提供更好的策略。第一章姜黄素诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞毒性研究为了考察姜黄素对乳腺癌细胞的作用机制,选择了两种典型的细胞株MCF-7和MDA-MB-231作为细胞模型。我们分别运用WST-1细胞毒性检测,克隆群落实验,细胞周期流式以及细胞形态学观察研究姜黄素对MCF-7和MDA-MB-231细胞的毒性作用。试验结果显示,姜黄素对两种细胞株均有毒性作用,但姜黄素对两个细胞株毒性的敏感性不一样,WST-1细胞毒性检测,克隆群落实验以及流式周期实验一致表明姜黄素对MDA-MB-231细胞表现出更大的毒性。第二章姜黄素对细胞凋亡调控因子caspase-3活性的影响因caspase-3是细胞凋亡的关键执行者,故我们采用Western Blotting方法检测姜黄素对其表达活性的影响。结果表明,姜黄素均可以上调两个乳腺癌细胞的caspase-3活性,其中MDA-MB-231细胞caspase-3活性上调更明显。Western Blotting的结果和第一章细胞毒性结果一致,姜黄素对MDA-MB-231细胞表现出更大的细胞毒性。同时提示姜黄素诱导乳腺癌细胞毒性的作用与caspase-3激活的细胞凋亡途径有关。第三章姜黄素调控MCF-7和MDA-MB-231细胞skp2-Cip/Kips信号通路的研究S期激酶相关蛋白2（skp2）,作为细胞周期中重要的调节因子,广泛的参与到肿瘤的发生,转移,血管生成,以及药物抗逆性作用中。Skp2介导的泛素化降解底物Cip/Kips家族蛋白p27,p21,p57被广泛的报道与化疗药物作用肿瘤细胞的毒性敏感性相关,我们检测了姜黄素作用这两个细胞skp2-Cip/Kips蛋白的变化。结果显示,在mRNA和蛋白水平上姜黄素明显抑制了skp2的表达,伴随着p27和p21浓度梯度和时问梯度的上调。在MCF-7细胞,我们仅在药物高浓度作用长时间才观察到skp2的抑制作用并伴随p27和p21的上调。姜黄素处理MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞,p57没有显著变化。与此同时40μM姜黄素作用MCF-7细胞3小时,skp2上调,6小时达到最高点。Skp2-SiRNA干扰skp2的表达后,MCF-7和MDA-MB-231细胞的skp2-SiRNA干扰株p27和p21均明显上调,P57变化不明显。结果提示姜黄素诱导细胞毒性的敏感性与其调控Skp2-Cip/Kips通路的抑制能力相关。同时WST-1细胞毒性测试结果显示姜黄素表现出对skp2-SiRNA干扰MCF-7细胞株和skP2-SiRNA干扰MDA-MB-231细胞株更强的细胞毒性,结果进一步肯定了skp2水平是姜黄素作用MCF-7和MDA-MB-231细胞毒性重要的决定因素。第四章姜黄素诱导不同细胞毒性差异性的分子机制研究（PI3K/AKT-Skp2通路）AKT磷酸化激活程度在决定细胞毒性的敏感性方面起重要的作用,同时AKT的活性是调节skp2变化的重要影响因子之一。我们进一步研究了姜黄素作用细胞PI3K/AKT相关信号通路的变化。结果显示姜黄素显著抑制了MDA-MB-231细胞AKT ser473位点磷酸化水平。相反,40μM姜黄素处理MCF-7细胞上调了其AKT ser473位点的磷酸化。同时我们观察到姜黄素处理两个细胞株AKT磷酸化底物p-foxol （Thr24）, p-foxo3a（Ser318/321）的表达也呈现出相反的变化。1μM wortmannin （PI3K/AKT抑制剂）和40μM姜黄素联合处理MCF-7细胞6小时,扭转了姜黄素引起的p-AKT（ser473）以及skp2的上调。同时,我们观察到1μM wortmannin单独作用MCF-7细胞6小时,skp2蛋白表达并没有显著下调,结合第3章结果40μM姜黄素单独处理MCF-7细胞24小时,skp2下调,而p-AKT依旧维持在高表达水平,提示姜黄素调控skp2代谢除了p-AKT途径可能还有其他途径。进一步确认PI3K/AKT信号通路在决定姜黄素诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞毒性敏感性中的作用。我们使用PI3K/AKT通路抑制剂（wortmannin）和姜黄素联用作用MCF-7和MDA-MB-231细胞。WST-l细胞毒性检测结果显示,对于抵抗株MCF-7细胞,药物联用克服（overcome）了姜黄素的抵抗且诱导的细胞毒性与姜黄度诱导敏感株细胞MDA-MB-231的毒性相当。对于敏感株细胞MDA-MB-231, wortmannin与姜黄素联用有药物协同作用,联合用药诱导的细胞毒性更大。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 姜黄素诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞毒性研究
• 摘要
• 前言
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 版图与说明
• 第二章 姜黄素对MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡调控因子caspase-3活性的影响
• 摘要
• 前言
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 版图与说明
• 第三章 姜黄素调控MCF-7和MDA-MB-231细胞Skp2-Cip/Kips信号通路的研究
• 摘要
• 前言
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 版图与说明
• 第四章 姜黄素诱导不同细胞毒性差异性的分子机制研究（P13K/AKT-Skp2通路）
• 摘要
• 前言
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 版图与说明
• 第五章 文献综述
• 摘要
• PI3K家族的概述
• PI3KI类信号通路在非病理和肿瘤中的作用
• 早期的PI3K抑制剂
• 最近的PI3KI类抑制剂：百花齐放
• 小结（PI3K/AKT抑制剂的未来之路）
• 附录
• 参考文献
• 已/待刊论文和专利
• 致谢