糖原磷酸化酶表达模式改变与肝癌生物学行为关系研究

论文摘要

研究背景和目的肝癌（Liver Cancer）是我国最常见的高发肿瘤之一,其发生发展是由体内多基因多蛋白参与、多步骤协同的复杂过程。临床上我们经常发现同一病理类型、同一分期、采用相同治疗方案的肝癌患者预后完全不同。这种预后差异,与肝癌的分子生物学行为密切相关。传统的肝癌病理诊断、分类、分型方法不能从分子水平反映其生物学行为,无法对肝癌的分子生物学行为做出准确的预测。因此,寻找能够反映肝癌分子生物学特性的标志物,并对其进行功能研究是肝癌研究的重要方向之一。糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase, GP）是糖原代谢过程中的限速酶,使糖原分解释放出1-磷酸葡萄糖（Glucose-1-phosphate,G-1-P）。GP主要分为三种亚型即肌型（Muscle-type GP, PYGM ）、肝型（Liver-type GP, PYGL）与脑型（Brain-type GP, PYGB）。其中PYGL主要位于成人的肝脏,维持血糖稳定;PYGB主要表达于成人大脑及低水平表达于胎肝,为人体应急时提供能量。研究显示,PYGB在肺腺癌、结肠癌等恶性肿瘤中表达升高,其在鼠肝癌细胞系中表达明显增高,取代PYGL成为主要的糖原磷酸化酶表达亚型,但在正常的肝脏表达极低或不表达。其在人肝癌中的表达未见报道。同时,这种糖原磷酸化酶表达模式的转变,即PYGL向PYGB的转变,是否意味着肝癌具有更加恶性的生物学行为（增殖快、分化低、侵袭性强）,至今未见报道。本研究通过研究肝癌中PYGB及PYGL的表达情况及其相关功能,并结合相关临床资料分析其表达与肝癌发生发展的关系,为寻找反映肝癌分子生物学特性的标志物提供了实验和理论依据。研究方法（一）研究PYGL及PYGB在肝细胞癌中的表达情况及其相关功能。1.运用Real-time PCR及Western blot检测PYGB及PYGL mRNA及蛋白在肝癌细胞中的表达。2.运用RT-PCR、Western blot、免疫组化技术检测临床HCC组织标本PYGB、PYGL表达情况。3.统计分析实验结果和临床病理资料,明确PYGB或PYGL表达模式改变与肝癌患者预后关系。4.构建PYGL或PYGB过表达质粒,建立PYGL或PYGB稳定细胞系。5.研究PYGL或PYGB表达对肝癌细胞增殖能力、侵袭能力的影响。6.观察PYGL或PYGB表达对肝癌细胞对抗外界刺激能力（缺血缺氧、H2O2）的影响。（二）研究PYGL及PYGB在肝内胆管细胞癌中的表达情况及其与临床预后的关系。1.运用RT-PCR、免疫组化技术检测临床ICC组织标本PYGB、PYGL表达情况。2.统计分析实验结果和临床病理资料,明确PYGB或PYGL表达模式改变与ICC患者预后关系。结果（一）PYGL及PYGB在肝细胞癌中的表达及其相关功能研究。1. PYGB基因转录水平与蛋白表达水平与肝癌细胞系的恶性程度密切相关,接近正常的肝癌细胞系以及低度恶性肝癌细胞系表达水平较低,在高度恶性的肝癌细胞系表达水平明显升高。2. PYGL基因转录水平与蛋白表达水平与肝癌细胞系恶性程度密切相关,在中度恶性肝癌细胞系表达增高,但在高度恶性的肝癌细胞系表达明显降低或缺失。3. PYGB与PYGL基因mRNA比值及蛋白比值与肝癌细胞系的恶性程度密切相关,随肿瘤恶性程度增强,比值增大。4. PYGB与PYGL基因mRNA比值与肝细胞癌患者BCLC分期呈正相关。5.在HCC样本中,PYGL在癌旁组织中均为强阳性,而癌组织则存在不同程度的高低表达。PYGB也主要表达于癌旁组织中,而癌组织表达则要低于癌旁。PYGB高表达的患者生存期和无瘤生成期均较短。6.构建了表达PYGL和PYGB的质粒,并分别构建和鉴定了Hep1-6和NIH3T3高低表达的稳定细胞系。7.过表达PYGB后细胞增殖、克隆形成及迁移能力明显增强。8.过表达PYGB后细胞抗氧化应激能力增强,相反上调PYGL表达,肝癌细胞抗氧化应激能力减弱。（二）PYGL及PYGB在肝内胆管细胞癌中的表达情况及其与临床预后的关系1.与正常胆管组织相比,PYGB的mRNA在ICC的表达水平明显增高,而PYGL的mRNA表达水平则明显降低。2. PYGB mRNA表达与γ-GT值负相关;而PYGL mRNA的表达与AFP呈正相关。3.免疫组化检测发现,PYGB表达相对较低的更容易发生淋巴结转移,并且预后相对较差,且PYGB低表达是OS的独立风险因素。结论1.在肝细胞癌中,PYGB、PYGL的表达模式,与肝癌细胞系的恶性程度密切相关。PYGB或PYGB与PYGL比值与患者预后密切相关,尤其是后者可能作为肝癌预后的一项有前景的指标。PYGB表达上调,肝癌细胞恶性生物学行为增强。2.在肝内胆管细胞癌中,PYGB表达水平增高,而PYGL表达下降;PYGB低表达患者易淋巴结转移,且预后更差,是OS的独立风险因素。研究背景和目的肝细胞性肝癌（简称肝癌,Hepatocellular Carcinoma,HCC）是我国最常见的高发肿瘤之一,目前研究认为:肝炎病毒感染和肝特异性致癌物是肝癌发生的主要外因;同时肝癌和其它恶性肿瘤一样,其发生和发展也是体内多基因参与、多步骤协同的复杂过程。因此,寻找肝癌的关键性、标志性基因,并进行功能研究是肝癌研究的重要方向之一。p300首次作为原癌蛋白E1A的结合蛋白被发现。它参与了一系列的生物学功能,如增殖、细胞周期的调控、凋亡、分化以及DNA损伤反应。p300作为转录因子可活化多种核蛋白,包括已知的癌蛋白（myb,jun,fos）和肿瘤抑制蛋白（如p53, E2F, Rb, Smads and BRCA1）。研究表明,p300是一种潜在的抑癌基因,与多种癌症有关的转录因子,具有组蛋白乙酰基转移酶（HATs）的活性,调节多种基因表达。目前研究表明多种肿瘤中存在p300/CBP的基因突变,如胃肠癌、急性髓细胞性白血病、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌和卵巢癌等。目前,尚无p300在肝癌中的相关研究报道,因此,本研究旨在通过研究p300在肝细胞癌组织中的表达水平,结合相关临床病理及预后资料探讨p300的表达与肝癌发生发展的关系,并初步研究p300在肝癌中的生物学作用,为进一步研究p300在肝癌中可能作用及为寻找肝癌治疗的新靶点提供实验和理论依据。研究方法:1.用Western blot检测p300蛋白在肝癌细胞中的表达情况;2.用RT-PCR、Western blot、免疫组化技术检测临床肝细胞癌组织标本p300表达情况;3.统计分析实验结果和临床病理资料,明确p300表达与肝癌患者预后关系;4.构建表达p300的真核表达质粒,建立可稳定表达p300的稳定细胞系;5.增殖实验研究过表达p300对细胞增殖的影响;6.流式细胞实验检测过表达p300对细胞周期的影响。结果:1. p300高表达于Hep3B、PLC/PRF/5、SMMC-7721及LM3等肝癌细胞系中;2. p300蛋白及mRNA在肝癌组织中均表达升高;3.免疫组化法显示p300蛋白主要表达于肝癌细胞核,在癌及癌旁组织中均有表达,癌中表达高于癌旁;4.癌及癌旁组织中p300的表达均与肿瘤复发呈正相关,癌组织中p300表达与AFP及子灶正相关,而癌旁组织中p300表达与HBsAg及子灶正相关。5.肝癌癌旁组织中p300高表达的肝癌患者总体生存率和无瘤生存率均明显低于p300低表达组（P =0.009,P=0.001）。此外,肝癌癌组织中p300高表达的肝癌患者无瘤生存率较低。6. p300促进HCC细胞增殖。7. p300促进HCC细胞周期进程。结论:p300在肝癌中表达升高,其高表达与肿瘤复发相关,肝癌癌旁组织中p300高表达的肝癌患者总体生存率和无瘤生存率均较低。而癌组织中p300高表达组无瘤生存率较低。细胞实验表明p300促进HCC细胞增殖及细胞周期进程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第一部分 糖原磷酸化酶表达模式改变与肝癌生物学行为关系研究
• 一、糖原磷酸化酶在肝细胞癌中的表达及其生物学行为研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 二、糖原磷酸化酶在肝内胆管细胞癌中的表达及其生物学行为研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 酰基转移酶p300 在肝细胞癌发生发展的作用及机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附录 文献综述
• 参考文献
• 在读期间发表论文和参加科研工作
• 致谢