二氮嗪预处理对小鼠肝移植缺血—再灌注损伤的保护作用及其机制研究

论文摘要

目的:一、研究二氮嗪预处理对肝细胞缺氧-复氧后Bcl-2蛋白表达及细胞凋亡的影响,探讨二氮嗪对肝细胞缺氧-复氧损伤的保护作用及其可能机制。二、摸索小鼠肝移植动物模型中应用RNA干扰技术沉默Bcl-2基因表达的方法。三、研究二氮嗪预处理对小鼠肝移植缺血-再灌注损伤的保护作用及其与凋亡调控相关的可能机制。方法:1.建立小鼠肝细胞缺氧-复氧损伤模型,细胞随机分为A组（缺氧-复氧损伤组）,B组（二氮嗪预处理组）和C组（正常对照组）,分别于细胞缺氧-复氧损伤后6h、12h、24h、48h、72h 5个时相点采集标本,检测肝细胞缺氧-复氧后细胞培养液中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）浓度,肝细胞Bcl-2 mRNA和蛋白表达及肝细胞凋亡率变化。2.建立小鼠同种异体原位肝移植模型,根据冷保存的时间随机分为A组（冷保存4h组）,B组（冷保存8h组）,C组（冷保存12h组）,通过各组小鼠移植术后14d存活情况做生存曲线分析;建立小鼠肝移植RNA干扰模型,利用化学合成Bcl-2基因的SiRNA,经门静脉高压注射途径导入供体肝脏。动物分为D组（供肝导入Bcl-2SiRNA组）,E组（供肝导入Bcl-2SiRNA 6h肝脏移植组）,F组（供肝导入Bcl-2SiRNA 24h肝脏移植组）和G组（正常对照组）。D组、E组、F组内分别设导入non-sence siRNA组为阴性对照。D组于SiRNA导入后6h、24h、48h、72h4个时相点采集标本,E组、F组和G组于移植术后24h采集标本,采用实时荧光定量PCR的方法检测Bcl-2mRNA表达变化。3.供肝导入Bcl-2SiRNA 24h摘取供肝建立小鼠肝移植RNA干扰模型,动物分为A组（冷保存2h肝移植组）、B组（供肝导入Bcl-2 SiRNA 24h冷保存2h移植组）、C组（二氮嗪预处理冷保存2h肝移植组）、D组（供肝导入Bcl-2 SiRNA 24h二氮嗪预处理冷保存2h肝移植组）和E组（供肝导入non-sence SiRNA24h冷保存2h移植组）。每组小鼠6只,移植术后24h采集标本,检测肝移植术后肝细胞病理形态学改变、血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）浓度,肝组织Bcl-2 mRNA和蛋白表达及肝细胞凋亡率变化。结果:1.在小鼠肝细胞缺氧-复氧损伤模型中,A、B组细胞培养液中ALT、AST浓度与C组比较明显升高（P<0.01） ,A、B两组之间比较,细胞培养液中ALT、AST浓度在缺氧-复氧6h差异无统计学意义（P>0.05）,12h、24h、48h和72h B组ALT、AST浓度明显低于A组（P<0.01）。A、B组肝细胞凋亡率均高于C组（ P < 0.01）,A、B两组之间比较,肝细胞凋亡率在缺氧-复氧6h差异无统计学意义（P>0.05）,12h、24h、48h和72h B组肝细胞凋亡率明显低于A组（P<0.01）。肝细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达,A组和C组中均较低,两组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）,B组中Bcl-2mRNA和蛋白表达明显高于A、C组,缺氧-复氧损伤6h、12h、24h、48h和72h B组与A组比较差异存在统计学意义（ P <0.01）。2.在小鼠肝移植模型中,A组术后生存率明显高于B组和C组。在小鼠肝移植RNA干扰模型中,D组Bcl-2mRNA表达量在6h开始明显下降,24h达到高峰,持续到72h,6h、24h、48h和72h Bcl-2mRNA表达较正常对照组分别减少36.0%、66.2%、61.8%、58.1%。E组小鼠肝脏组织中Bcl-2mRNA表达较G组减少33.3%,F组较G组减少58.9%,F组与E组两组之间比较,F组肝脏组织中Bcl-2mRNA表达较E组减少38.1% ,两组之间差异有统计学意义（P<0.05）。3.在二氮嗪预处理小鼠肝移植实验中,C组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平较A组明显增高（P<0.01）,Bcl-2mRNA和蛋白表达分别增加2.6倍和5.1倍;B组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平较A组明显降低（P<0.01）,Bcl-2mRNA和蛋白表达分别被抑制57.1%和83.4%;D组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平较A组明显降低（P<0.01）,Bcl-2mRNA和蛋白表达分别减少53.3%和67.6%;B组与D组两组之间比较Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。C组中肝细胞病理损伤程度、凋亡指数、血清AST、ALT含量明显低于各组。B组和D组中肝细胞病理损伤程度、凋亡指数、血清AST、ALT含量明显高于各组。在各组中Bcl-2表达量与缺血再灌注损伤程度和肝细胞凋亡指数呈负相关。结论:1.二氮嗪预处理能通过抑制肝细胞凋亡,起到保护肝细胞缺氧-复氧损伤的作用,其保护机制可能与上调Bcl-2表达有关。2.采用门静脉高压注射途径向肝脏导入Bcl-2 siRNA 24h后摘取供肝的方法建立肝移植模型,能在小鼠肝移植体内实现Bcl-2基因的有效沉默。3.二氮嗪预处理可能通过诱导Bcl-2表达,抑制肝细胞凋亡,从而减轻小鼠肝移植缺血-再灌注损伤。

论文目录

• 英文缩写词表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 二氮嗪预处理对小鼠肝移植缺血－再灌注损伤的保护作用及其机制研究
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 二氮嗪对缺氧－复氧后肝细胞Bcl-2 蛋白表达及细胞凋亡影响的初步研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 小鼠同种异体原位肝移植和RNA 干扰动物模型的建立
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 二氮嗪预处理对肝移植缺血－再灌注损伤小鼠肝细胞凋亡及Bcl-2 蛋白表达影响的初步研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 照片
• 文献综述一 肝脏缺血－再灌注损伤与预处理的研究进展
• 参考文献
• 文献综述二 RNA 干扰技术及其在活体的应用
• 参考文献
• 攻读博士期间发表文章
• 英文论著