鼻咽癌相关新基因NPCEDRG抑瘤功能初步研究

论文摘要

第一部分Tet系统调控NPCEDRG基因表达CNE2细胞系的建立及其功能研究目的:本研究利用Tet-on调控系统,建立受强力霉素诱导NPCEDRG基因表达的CNE2细胞系,观察NPCEDRG高表达后对CNE2细胞生物学行为的影响,探讨NPCEDRG基因抑瘤功能及其可能机制,为深入研究NPCEDRG基因功能提供一个较为理想的细胞系。方法:构建重组真核表达载体pRevTRE-NPCEDRG;先后将pRevTet-on调控质粒和pRevTRE-NPCEDRG反应质粒转染CNE2细胞系,分别用G418和潮霉素进行两轮筛选,1000ng/ml强力霉素（Doxcycline,Dox）诱导,运用RT-PCR鉴定,筛选低背景及高诱导活性的细胞克隆,扩大培养备作后续实验。以不同浓度Dox诱导Tet/TRE-NPCEDRG/CNE2细胞,RT-PCR检测NPCEDRG基因的mRNA表达水平,确定Dox的最佳诱导浓度。采用最佳诱导浓度的Dox,分别诱导CNE2、Tet/TRE/CNE2、Tet/TRE-NPCEDRG/CNE2三组细胞,通过HE染色、生长曲线绘制、软琼脂集落形成试验及流式细胞仪分析等方法,比较分析NPCEDRG基因高表达,对CNE2细胞形态、增殖速度、非停泊依赖性生长能力和细胞周期的影响。结果:当Dox浓度为0-3000ng/ml,Tet/TRE-NPCEDRG/CNE2细胞系受Dox诱导NPCEDRG基因表达水平,呈现浓度依赖性增高,Dox最佳诱导浓度为3000ng/ml。我们以3000ng/ml Dox分别诱导CNE2、Tet/TRE/CNE2及Tet/TRE-NPCEDRG/CNE2三组细胞,结果显示,转基因细胞与对照组比较,转基因细胞核浆比变小,病理核分裂像减少,分化程度增高;细胞生长速度减慢（P＜0.05）;软琼脂中克隆形成能力显著降低（P＜0.01）;G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例下降,细胞生长分数降低,肿瘤细胞被阻滞于G0/G1期。结论:1.成功建立Tet调控NPCEDRG基因表达的CNE2细胞系,为进一步研究NPCEDRG基因的功能提供一个理想的细胞模型。2.NPCEDRG高表达,能抑制CNE2细胞生长增殖,将细胞阻滞于G0/G1期,诱导细胞向成熟方向分化,部分逆转鼻咽癌CNE2细胞系的恶性表型。第二部分随机突变NPCEDRG基因功能位点分析目的:本研究利用PCR错配随机突变的方法,构建NPCEDRG基因的突变重组表达载体,将其导入CNE2细胞系,分析NPCEDRG基因突变对其生物学功能的影响,探明NPCEDRG基因的功能位点。方法:利用PCR过程中的碱基错配,随机突变产生NPCEDRG的突变体;利用生物信息学,分析突变后NPCEDRG蛋白质结构的改变。将野生型及突变型NPCEDRG基因的编码区cDNA,分别插入pcDNATM3.1/myc-HisB真核表达载体,构建野生型及突变型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG重组表达载体。将pcDNATM3.1/myc-HisB空载体、野生型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG及突变型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG重组表达载体,分别转染CNE2细胞,通过生长曲线绘制及流式细胞仪分析,比较转野生型CNE2与转突变型CNE2细胞之间生长速度和周期分布的差异,结合生物信息学分析结果,评价NPCEDRG基因突变点对其功能的影响,寻找NPCEDRG基因功能结构位点。结果:通过PCR方法,制备一个NPCEDRG突变体,该突变体含有两个突变点,分别为T260-C260和T287-C287,相应氨基酸序列改变为V73-A73和M82-T82。野生型及突变型NPCEDRG基因编码序列,分别插入pcDNATM3.1/myc-HisB载体,成功构建的野生型及突变型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG重组表达载体,分别转染CNE2细胞,建立野生型与突变型转基因CNE2细胞系。研究结果发现,转基因组与对照组比较,转基因细胞生长速度均减慢（P＜0.05）,G0/G1期细胞比例均增加,S期细胞比例均下降,细胞生长分数均降低,肿瘤细胞均被阻滞于G0/G1期;而转突变型组与转野生型组间,细胞增殖速度及细胞周期分布相似,差异无显著性意义（P＞0.05）。结论:1.成功构建带His标签的NPCEDRG基因重组表达载体,为深入NPCEDRG基因功能研究奠定工作基础。2.NPCEDRG基因T260-C260和T287-C287突变,不引起NPCEDRG基因功能改变,其编码的蛋白质第73位和第82位氨基酸,可能不是NPCEDRG蛋白质必需功能性位点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 1 前言
• 2 技术路线
• 3 材料与方法
• 4 结果
• 第一部分 Tet系统调控NPCEDRG基因表达CNE2细胞系的建立及其功能研究
• 第二部分 随机突变NPCEDRG功能位点分析
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 附录一
• 综述
• 附录二
• 致谢