重组人血管内皮抑素的心脏毒性及其机制研究

论文摘要

背景与目的:1971年哈佛大学医学院Folkman教授首先提出“肿瘤生长和转移依赖于新生血管生成,阻断血管生成是遏制肿瘤生长的有效策略”的理论,由此开创了肿瘤抗血管生成治疗的研究。近年来,针对肿瘤新生血管这个靶点新的抗癌药物（如贝伐单抗、索拉非尼、舒尼替尼）已经从实验室走向临床应用,并取得了良好的疗效。除此之外,做为广谱内源性血管生长抑制因子—内皮抑素（Endostatin）在小鼠体内可使93～97%肿瘤停止生长,成为全球最引人注目的抗血管生成药物。然而在以后临床应用中却发现Endostatin在人体内活性很低,科学家无法攻克蛋白质复性的技术难关,生产成本过高无法实现Endostatin的大规模生产。我国学者罗永章等经过长期不懈的努力,解决该蛋白复性的技术难关,创造的改变了Endostatin的氨基酸序列,使该蛋白的药用性能和疗效得到了显著提高。就是这个我国自主研发的新型重组人血管内皮抑素（Recombinant human endostatin,rh-Endostatin,Endostar,恩度）,于2005年9月获得了国家食品药品监督管理局颁发的生物制品一类新药证书,它是世界上首例血管内皮抑制素抗癌新药。2006年7月恩度在我国上市开始临床使用,对晚期肺癌的治疗显示出较好的疗效。据恩度治疗说明书描述,Ⅰ～Ⅲ期临床试验安全性评价指出,470例受试晚期非小细胞肺癌患者中有30例（6.38%）出现了心脏不良反应,主要表现为用药初期少数患者出现轻度疲乏、胸闷、心慌等症状,用药后第2～7天内发生心肌缺血,以及心电图出现窦性心动过速、轻度ST-T改变、房室传导阻滞、房性早搏、偶发室性早搏等,研究者认为以上心脏不良反应均为轻.中度,未危及患者生命,其中6.4‰的患者症状较为明显,但均为可逆性,多数不影响治疗进行,不需要对症治疗即可缓解。然而,笔者在恩度临床使用过程中,却发现其心脏毒性发生率和严重程度要高于药物说明书的描述,部分患者因心脏毒性暂停治疗,部分患者需要经对症治疗心脏毒性才能缓解,甚至有一例晚期非小细胞肺癌患者在恩度联合健择治疗的第7天,出现急性左心衰,心电图提示窦性心动过速,心率110～120次/分,偶发室早,N端前脑利尿肽（NT-proBNP）升高到15859pg/ml,最终因心力衰竭医治无效死亡,患者既往有高血压病史8年,用药前心脏功能正常。综合以上,根据我肿瘤治疗中心的用药体会,认为恩度的心脏毒性发生比较广泛,严重性尚待进一步评价。目前临床医生对其心脏毒性的发生警惕性尚不够,关于心脏毒性的早期诊断和预测也应开展研究。既往研究多集中于蒽环类药物或放疗所致的心脏毒性,然而,随着分子靶向药物临床逐渐广泛,越来越多的分子靶向药物心血管不良反应逐渐被发现并受到研究者重视,有关心脏毒性的研究热点也转向了分子靶向药物,其发生机制也有了初步的研究。研究表明单独使用曲妥珠单抗,有4-7%发生心功能不全,尤其是充血性心衰（GHF）和左室射血分数（LVEF）的减少,发生机制可能与心脏组织上的HER-2受体的分化和存活有关。Nature Medicine一篇文章指出,伊马替尼可能增加化疗患者发生心力衰竭的风险,研究者推测,伊马替尼可能是通过抑制心肌细胞上的ABL激酶,并影响细胞内蛋白质合成,从而导致了对心肌细胞的损伤。舒尼替尼也有心脏毒性的报道。尽管临床前试验认为恩度心脏毒性不是十分严重,然而使用过程中出现了左心衰严重不良心血管事件。心脏的副作用是恩度最常见并且是最有可能危及生命的毒副反应,因此,有必要对恩度心脏毒性的严重程度再次评价,筛选临床早期诊断和预测的指标。从长远上考虑,对于心脏毒性的了解越深入越利于新药的国际推广应用。研究表明分子靶向药物的心脏毒性机制不同于蒽环类药物,前者心脏毒性多与药物作用的靶点密切相关,并且信号转导通路参与心脏毒性的机制。研究者也认为每种分子靶向药物的心脏毒性机制都不完全相同,故关于恩度发生心脏毒性的机制需要深入研究。基于上述理论,本研究试图从临床观察和实验研究两方面评价rh-Endostatin的心脏毒性,筛选早期诊断和预测临床指标,并初步探讨其心脏损伤的可能机理。方法:1.将既往使用恩度联合化疗的11例晚期肿瘤患者的资料进行回顾性分析,包括治疗过程中有无心慌、胸闷、呼吸困难等临床症状及症状发生时间,治疗前后心电图（ECG）,心肌酶谱及LVEF的改变,评价恩度心脏毒性,并初步筛选心脏毒性早期诊断临床指标。2.为客观评价心脏毒性以及全面筛选心脏毒性早期临床诊断指标,设计了前瞻性临床实验,选择恩度联合化疗18例,单纯化疗12例为对照研究,每周期用药的d0、d15检测ECG、LVEF、CK-MB、cTnT和NT-proBNP等多项指标。3.24只实验大鼠随机分成4组,每组6只。对照组以等体积生理盐水腹腔注射,rh-Endostatin低、中、高三个剂量组,分别给与3mg/kg、6mg/kg、12mg/kg腹腔注射,每日一次,每组各半大鼠（3只）分别给药4周和8周时间,均在末次给药后24h杀死。HE染色各组大鼠心肌组织,光镜下观察病理形态学改变;透射电镜观察大鼠心肌组织超微结构的病理改变;通过TUNEL方法检测大鼠心肌细胞凋亡;通过CD34来标记内皮细胞进行免疫组织化学检测,检测大鼠心肌组织的微血管密度改变。4.分别以100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml三个不同剂量的rh-Endostatin处理H9c2心肌细胞24h、48h,不加药物作为对照组,通过Annexin V/PI双染流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率。400μg/ml rh-Endostatin处理H9c2心肌细胞24h,不加药物作为对照组,透射电镜观察心肌细胞超微结构的改变。400μg/mlrh-Endostatin处理H9c2心肌细胞,不加药物作为对照组,琼脂糖凝胶电泳DNA Laddering方法检测细胞凋亡。5.体外培养H9c2心肌细胞进行细胞凋亡的发生机制研究。以100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml rh-Endostatin三个不同剂量和不加药物对照组进行实验研究,通过共聚焦显微镜检测心肌线粒体膜电位变化,细胞免疫化学方法进行细胞色素C释放实验、化学发光法测心肌细胞胞内ADP与ATP比值的改变。400μg/ml rh-Endostatin处理H9c2心肌细胞14h、28h,不加药物为对照组,Western Blotting方法检测p-JNK和p-eIf2α的表达水平,研究rh-Endostatin产生细胞凋亡的信号转导机制。通过免疫荧光方法细胞定位检测H9c2心肌细胞核仁素的表达,初步探讨rh-Endostatin的心肌毒性作用受体。结果:1.回顾性研究结果提示,rh-Endostatin联合化疗治疗后与治疗前比较心电图异常率有统计学意义（χ2=6.471,P=0.035）。治疗后与治疗前比较,心肌酶谱中CK-MB升高具有统计学性意义（t=2.530,P=0.030）,其他几种心肌酶变化无统计学意义（P＞0.05）。治疗前与治疗后比较LVEF值的改变无统计学意义（t=2.083,P=0.075）。2.前瞻性对照研究结果提示,rh-Endostatin联合化疗组患者治疗后ECG异常改变率以及CK-MB、cTnT和NT-proBNP均轻度升高,第一周期治疗后与单纯化疗组比较,ECG异常改变两组有统计学差异（χ2=6.087,P=0.024）,而LVEF值的改变两组比较无统计学差异（P＞0.05）,两个周期治疗后两组比较CK-MB、cTnT均有统计学差异（P均＜0.05）,两个周期治疗后两组比较NT-proBNP差异均有统计学意义（P均＜0.01）。3.体内实验结果提示,HE染色光镜下观察显示正常对照组心肌纤维排列整齐,无心肌纤维的破坏,细胞质丰富均匀,细胞间隙正常,无水肿;Rh-Endostatin高剂量组4周和8周均可观察到心肌纤维排列紊乱,肌间隙扩大,心肌细胞结构模糊,变性坏死,局部心肌细胞核溶解或消失;心外膜下中性粒细胞及单核、淋巴细胞浸润,8周病理形态改变较4周损害程度加重。Rh-Endostatin中、低剂量组心肌组织无明显病理改变。透射电镜下观察对照组大鼠心肌肌丝排列整齐规则,细胞器无水肿和变性。Rh-Endostatin高剂量4周组和8周组均可见心肌线粒体肿胀、变性,嵴疏松、断裂,肌丝溶解,肌浆网扩张明显,8周超微结构改变较4周更为明显。Rh-Endostatin中剂量组和低剂量组无明显病理形态学改变。TUNEL法测心肌细胞凋亡,镜下观察对照组、rh-Endostatin低剂量组未见心肌凋亡细胞,中剂量组少见凋亡细胞,高剂量组可见较多凋亡细胞。将各组凋亡指数进行统计学分析,提示rh-Endostatin 4周高剂量组凋亡指数显著高于正常对照组,有统计学差异（P=0.004）;8周中剂量和高剂量与对照组相比较有统计学差异（P=0.033、P=0.000）。8周高剂量组凋亡指数最高。用CD34免疫组织化学标记内皮细胞,对心肌组织微血管计数,结果提示高剂量rh-Endostatin组4周和8周可观察到血管密度增加,显著高于正常对照组,有统计学意义（P＜0.05）。4周高剂量组微血管密度最高。4.Annexin V/PI双染法检测心肌细胞早期凋亡率,结果提示四组相比有统计学意义（F=126.492,P=0.000）,其中200、400μg/ml组与对照组相比有显著统计学意义（P=0.000）,400μg/ml组凋亡率最高,表明rh-Endostatin能诱导心肌细胞凋亡,并且具有剂量依赖性。结果也提示药物作用时间对凋亡的影响有统计学差异（F=2.927,P=0.092）,24h凋亡率高于48h。用400μg/mlrh-Endostatin处理H9c2心肌细胞30h后,DNA被切成不同大小的条带,形成DNA Ladder,而未处理的细胞则是完整的一条带,没有Ladder产生。用400μg/ml rh-Endostatin处理24h后,电镜下可见心肌细胞内空泡增多,核固缩碎裂,凋亡小体产生,内质网扩张,线粒体肿胀,形态变圆,嵴疏松、断裂、消失,染色质块聚。而未处理的心肌细胞核大小形态正常,细胞器无损伤。5.100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的rh-Endostatin处理H9c2细胞18h后,发现随着剂量的增加线粒体跨膜电位下降明显。细胞色素C释放实验提示未药物处理细胞的细胞色素C主要以胞内点状形式分布,表明它主要分布于线粒体中,400μg/ml处理24h后,细胞色素C移位,均匀分布于整个细胞中,表明它已从线粒体向胞浆释放。100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的rh-Endostatin处理H9c2细胞24h后,用无药物作为正常对照,四组之间ADP/ATP值比较有统计学意义（P=0.000）,200μg/ml组和400μg/ml组与对照组相比有统计学意义（P均＜0.01）。分别于14h和28h收集400μg/ml rh-Endostatin处理细胞蛋白样本,发现药物处理后的p-JNK和p-eIF2a蛋白水平明显高于正常对照组,p-JNK和p-eIF2a的表达随着时间的延长而升高,药物处理14h和18h后p-JNK和p-eIF2a水平与正常对照组相比较均具有统计学差异（P均＜0.01）。免疫荧光定位提示H9c2细胞膜上表达核仁素,药物干预后表达量增多,胞浆表达明显增多。结论:1.初步显示重组人血管内皮抑素联合化疗存在轻度的心脏不良反应,对心肌有一定的损伤,但是短期内心功能未受到明显改变。CK-MB和心电图可作为早期监测心脏毒性的检查指标。在重组人血管内皮抑素联合化疗的过程中应该警惕心脏不良反应的发生。2.心电图以及CK-MB、cTnT和NT-proBNP可作为早期监测心脏毒性的临床指标。CK-MB、cTnT和NT-proBNP三种心肌生化标志物联合检测,有助于提高预测rh-Endostatin心肌损伤的敏感性和准确性。3.高剂量的rh-Endostatin对大鼠心肌有明显病理改变,并观察到超微结构的损伤,TUNEL方法也观察到高剂量组大鼠心肌组织凋亡细胞增多,提示心肌细胞凋亡机制参与了rh-Endostatin心脏毒性的病理过程。4.体外实验从细胞的形态学和生化特征证实了rh-Endostatin对H9c2心肌细胞有凋亡作用,推测心肌细胞凋亡可能是导致心脏毒性的重要原因。5.Rh-Endostatin对心肌细胞的毒性机制是因于rh-Endostatin激活了线粒体和内质网应激两条凋亡途径,造成了心肌细胞的凋亡。通过对核仁素的定位表达检测证实核仁素在心肌细胞膜表达,药物作用后核仁素转位,初步推测此膜表面核仁素可能是rh-Endostatin造成心脏毒性的作用受体。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 重组人血管内皮抑素心脏毒性的临床观察
• 第一章 回顾性研究
• 1 资料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第二章 前瞻性研究
• 1 资料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第二部分 重组人血管内皮抑素对大鼠心脏的毒性作用
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第三部分 重组人血管内皮抑素对体外心肌细胞的毒性作用
• 第一章 重组人血管内皮抑素对心肌细胞的凋亡作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第二章 线粒体通路介导的细胞凋亡途径研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第三章 内质网应激通路的细胞凋亡途径研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第四章 重组人血管内皮抑素心肌细胞毒性作用受体
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 全文小结
• 综述
• 英文缩略词
• 成果
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明