论文题目: ARI筛选模型的建立及黄芪甲苷对VSMC生长的影响和机制研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物医学工程
作者: 肖尚志
导师: 郑筱祥
关键词: 醛糖还原酶抑制剂,平滑肌细胞,模型,药物筛选,黄甲苷,增殖,凋亡,钙离子,一氧化氮
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 糖尿病是一种伴有诸多严重并发症的疾病,在退行性糖尿病并发症病变的发生和发展过程中,多元醇代谢通路(polyol pathway)起了十分重要的作用。醛糖还原酶(aldose reductase,AR)是多元醇代谢通路中的关键限速酶,是治疗糖尿病并发症的靶位酶,该酶以NADPH为辅酶,使葡萄糖还原为不易透过细胞膜的山梨醇,引起细胞的渗透性损伤,是糖尿病并发症发生的重要原因。目前许多前沿研究已经证实,糖尿病慢性并发症如白内障,糖尿病视网膜病,糖尿病神经病,糖尿病肾病等,都与体内山梨醇的蓄积密切相关。大量动物实验和临床研究表明,醛糖还原酶抑制剂(aldose reductase inhibitor,ARI)可以有效地改善糖尿病患者聚醇代谢异常,从而预防与延缓糖尿病并发症的发生与发展。由于目前可用于治疗糖尿病并发症的药物不足以满足临床需要,现有的醛糖还原酶抑制剂索比尼尔和托瑞司他等有不同程度的副作用。因而发现和寻找新的安全有效的醛糖还原酶抑制剂显得非常有必要。本研究的目的就是建立一种简便、可靠并可以用于高通量筛选的醛糖还原酶抑制剂筛选模型,并在模型的基础上进行了相关的药物筛选以及药物作用机制的研究。 1、建立了可用于从中药及其他化合物中筛选醛糖还原酶抑制剂的细胞模型。通过组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞,高效液相色谱测定反应体系中反应后剩余的醛糖还原酶的辅酶NADPH的荧光强度,推算出反应体系中醛糖还原酶的活性,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测醛糖还原酶mRNA的表达。用这些方法检测了培养在含有不同浓度葡萄糖的DMEM中平滑肌细胞不同时间点的醛糖还原酶活性及醛糖还原酶mRNA表达情况,结果发现,当平滑肌细胞在葡萄糖浓度为37.5mmol/L,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)浓度为10%的DMEM中孵育48小时后醛糖还原酶活性最强(P<0.01),醛糖还原酶mRNA的表达量最高,从而确定了促使平滑肌细胞内AR活性增强的最佳葡萄糖浓度和最佳孵育时间。已知的醛糖还原酶抑制剂Epalrestat对在葡萄糖浓度为37.5mmol/L,FBS浓度为10%的DMEM中孵育48小时的平滑肌细胞醛糖还原酶抑制剂活性有显著的抑制作用(P<0.01),验证了模型的可行性。根据这些实验结果建立了基于平滑肌细胞的醛糖还原酶抑制剂筛选的细胞模型。
论文目录:
摘要
ABSTRACT
第一章 醛糖还原酶抑制剂筛选模型的建立
第一节 概述
§1.1 糖尿病慢性并发症
§1.1.1 醛糖还原酶催化的多元醇旁路的激活
§1.1.2 蛋白激酶C(PKC)激活
§1.1.3 蛋白质非酶糖基化
§1.1.4 脂质、蛋白质代谢紊乱
§1.2 糖尿病并发症治疗药物的研究与开发现状
§1.3 本课题的研究目的及意义
第二节 醛糖还原酶抑制剂筛选模型建立
§2.1 平滑肌细胞培养和鉴定
§2.1.1 实验动物、实验器材、实验试剂
§2.1.2 平滑肌细胞原代培养操作方法与步骤
§2.1.3 培养结果及鉴定
§2.2 醛糖还原酶活性及醛糖还原酶mRNA表达测定方法
§2.2.1 实验器材、实验试剂
§2.2.2 醛糖还原酶活性测定方法
§2.2.3 醛糖还原酶mRNA水平测定-逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)
§2.3 促使VSMC细胞内AR高活性最适孵育时间的确定
§2.3.1 实验器材、实验试剂
§2.3.2 细胞处理及实验分组
§2.3.3 实验结果
§2.4 促使VSMC细胞内AR高活性的最佳葡萄糖浓度的确定
§2.4.1 实验器材、实验试剂
§2.4.2 细胞处理及实验分组
§2.4.3 实验结果
§2.5 阳性药依帕司对模型AR活性的影响
§2.5.1 实验器材、实验试剂
§2.5.2 细胞处理及分组
§2.5.3 实验结果
第三节 基于模型的相关药物筛选
§3.1 含药血清筛选
§3.1.1 含药血清的制备
§3.1.2 细胞分组与处理
§3.1.3 含药血清筛选结果
§3.2 中药单体的筛选
§3.2.1 细胞分组与处理
§3.2.2 筛选结果
第四节 分析与讨论
第二章 黄芪甲苷对平滑肌细胞增殖的抑制作用及相关机制研究
第一节 概述
§1.1 血管平滑肌细胞的生物学功能
§1.2 平滑肌细胞增殖与动脉粥样硬化的关系
§1.3 平滑肌细胞凋亡与动脉粥样硬化的关系
§1.3.1 VSMC凋亡与AS
§1.3.2 VSMC凋亡的信号传递与基因调控
§1.4 平滑肌增殖和凋亡及相关机制探讨方法
§1.4.1 细胞增殖活力检测方法(WST)
§1.4.2 细胞凋亡检测的相关方法
§1.4.3 细胞内钙离子检测的相关方法
第二节 黄芪甲苷对平滑肌细胞生长的抑制作用及相关机制研究
§2.1 前言
§2.2 黄芪甲苷对平滑肌细胞增殖活力的影响
§2.2.1 实验材料
§2.2.2 细胞分组及增殖活力检测
§2.2.3 结果统计
§2.2.4 实验结果
§2.3 黄芪甲苷对平滑肌细胞凋亡的影响
§2.3.1 实验材料
§2.3.2 细胞处理与分组及凋亡检测
§2.3.3 黄芪甲苷对平滑肌细胞凋亡的影响
§2.4 凋亡相关基因Fas和Bcl-2表达的检测
§2.4.1 实验材料
§2.4.2 实验操作与步骤
§2.4.3 实验结果
§2.5 黄芪甲苷对平滑肌细胞细胞内钙离子浓度的影响
§2.5.1 实验材料
§2.5.2 细胞处理及细胞内钙离子检测
§2.5.3 黄芪甲苷对平滑肌细胞细胞内ca~(2+)的影响
§2.6 黄芪甲苷对平滑肌细胞一氧化氮的影响
§2.6.1 实验材料
§2.6.2 细胞处理及细胞内NO检测
§2.6.3 实验结果
第三节 分析与讨论
§3.1 黄芪甲苷抑制平滑肌细胞增殖及机制
§3.1.1 AR与平滑肌细胞增殖
§3.1.2 NO与平滑肌细胞增殖
§3.2 黄芪甲苷诱导平滑肌细胞凋亡及机制
§3.2.1 NO与平滑肌细胞凋亡
§3.2.2 钙离子与平滑肌细胞凋亡
§3.2.3 Fas与平滑肌细胞凋亡
§3.2.4 Bcl-2与平滑肌细胞凋亡
总结与展望
1、研究工作总结
2、进一步的工作展望
博士期间相关论文发表情况
参考文献
致谢
发布时间: 2005-07-15
参考文献
- [1].胚胎干细胞或胚胎样干细胞向血管细胞的分化及调控机制研究[D]. 孙璇.中南大学2010
- [2].胚胎干细胞来源平滑肌细胞的纯化及功能研究[D]. 田孝祥.大连医科大学2009
- [3].缺氧诱导大鼠海绵体平滑肌细胞表型转化及红景天苷干预作用[D]. 吕伯东.浙江大学2014
- [4].VEGF增加内皮细胞对脂蛋白通透性的机制研究[D]. 王杰松.第二军医大学2002
- [5].胃肠动力障碍分子机制和大黄素作用机理研究[D]. 马涛.天津医科大学2002
- [6].脂联素在内质网应激致血管钙化过程中的作用及其机制[D]. 鲁燕.山西医科大学2015
- [7].牙髓干细胞克隆差异及其应用于神经和平滑肌再生方面的初步研究[D]. 蒋文凯.第四军医大学2016
- [8].人脂肪干细胞向平滑肌细胞分化的分子机制研究[D]. 凯赛尔·阿吉.新疆医科大学2016
- [9].杜鹃素新结构衍生物DJS-F抑制大鼠血管内膜增生作用及其机制[D]. 刘恩荔.山西医科大学2016
- [10].基于CysLTs通路探讨三子养亲汤控制哮喘的机制研究[D]. 徐升.成都中医药大学2016
相关论文
- [1].糖性白内障相关方法学、病理机制及药物作用研究[D]. 冀立霞.中国协和医科大学2009
- [2].黄芪甲苷对糖尿病血管重构的保护作用及其相关机制研究[D]. 袁巍.浙江大学2009
- [3].蒙古黄芪的化学成分研究[D]. 马晓丰.沈阳药科大学2003
- [4].黄芪甲苷和苄达赖氨酸对早期糖尿病肾病的防治作用及其机制[D]. 印晓星.南京医科大学2004
- [5].Ⅱ型糖尿病/代谢综合症药物筛选及机制研究[D]. 徐铭恩.浙江大学2005
- [6].醛糖还原酶在非糖尿病性肾小球肾炎和肾脏纤维化过程中的作用及机制研究[D]. 蒋涛.复旦大学2005
- [7].中药黄芪及其活性部位对血管舒缩功能作用的研究[D]. 张必祺.浙江大学2006
- [8].黄芪甲苷和苄达赖氨酸防治糖尿病周围神经病变的药效学、药动学及PD-PK结合模型研究[D]. 余俊先.南京医科大学2006
- [9].黄芪甲苷对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D]. 关凤英.吉林大学2007
- [10].黄芪甲苷定向诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究[D]. 喻锦扬.广州中医药大学2007
标签：醛糖还原酶抑制剂论文; 平滑肌细胞论文; 模型论文; 药物筛选论文; 黄甲苷论文; 增殖论文; 凋亡论文; 钙离子论文; 一氧化氮论文;