论文摘要
目的为探讨川陈皮素（nobiletin；5，6，7，8，3’，4’-hexamethoxyflavone）对肝癌细胞的抑制作用及作用机理，拟在本课题中，通过体内外实验观察不同剂量的川陈皮素对人肝癌SMMC-7721细胞和鼠肝癌H22细胞增殖及生物学性状的影响，并探讨产生这种影响的原因。方法用MTT法分析2、4、8、16、32、64、128 mg·L-1的川陈皮素对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用，并计算半数抑制浓度IC50；以10mg·L-1，20mg·L-1，40 mg·L-1川陈皮素，阿霉素0．05 mg·L-1为阳性对照作用于SMMC-7721细胞绘制7天生长曲线；以10mg·L-1，20mg·L-1，40 mg·L-1川陈皮素，阿霉素0．05 mg·L-1为阳性对照作用于SMMC-7721细胞，观察细胞的集落形成情况，并计算集落形成抑制率。为探讨川陈皮素对SMMC-7721的抑制作用机理是否为诱导凋亡，以2．5 mg·L-1，5 mg·L-1，10 mg·L-1，20 mg·L-1，40 mg·L-1川陈皮素作用48小时后，Giemsa染色观察细胞形态变化，Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态变化；制作细胞爬片，以20mg·L-1，40 mg·L-1，80 mg·L-1川陈皮素组作用于SMMC-7721细胞24小时后进行SP法免疫组化染色，检测Caspase-3蛋白表达情况；以10 mg·L-1，20 mg·L-1，40 mg·L-1川陈皮素分别处理SMMC-7721细胞48小时，流式细胞计数检测细胞周期的改变、凋亡率及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。并且建立小鼠H22肝癌移植性实体瘤模型用于研究川陈皮素对肝癌的体内抑制作用，免疫组化用于检测凋亡相关蛋白COX-2、Caspase-3、Bax和Bcl-2。结果MTT提示川陈皮素浓度为2～128 mg·L-1时，对SMMC-7721细胞的48小时抑制率为3％～80％，作用48小时的IC50为26．2 mg·L-1；生长曲线提示川陈皮素对SMMC-7721细胞的抑制作用呈明显时效和量效关系；集落形成抑制实验结果表明药物浓度在10 mg·L-1～40 mg·L-1对SMMC-7721细胞集落形成抑制率为57％～97％；20 mg·L-1药物作用48小时，Giemsa染色后在光镜下可见多数细胞出现形态改变，胞体变小，胞质中颗粒增多并可见细胞膜出泡，或呈拉丝状。核质比增大，核变形、皱缩。大部分死细胞很快崩解、坏死，出现典型的凋亡特征；Hoechst 33258染色后细胞核出现固缩，染色质不均一或边集呈致密强荧光，产生凋亡小体等明显的凋亡形态学变化；免疫组化方法检测到Caspase-3蛋白表达随着作用药物剂量的增加而显著增加；流式细胞仪检测到G2／M期细胞增多，S期细胞明显减少，细胞周期阻滞于G2／M期；随着剂量的增加凋亡率明显增高；检测各剂量组凋亡峰，40 mg·L-1，组可见到明显的Sub-G1凋亡峰；经药物处理后，胞浆Bax蛋白的表达上调，20 mg·L-1、40 mg·L-1组与阴性对照组相比有显著性差异，Bcl-2蛋白的表达无明显改变，Bcl-2／Bax值降低。体内实验表明，川陈皮素剂量为500 mg·kg-1，口服灌胃给药10天，对小鼠移植性肿瘤H22有一定的抑制作用，抑制率为48．35％，与阴性对照组相比有显著性差异（P＜0．01），并呈剂量依赖性，且对小鼠免疫系统无明显抑制作用；免疫组化结果表明，川陈皮素可以通过下调COX-2蛋白表达，同时增加Bax、Caspase-3蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达，从而诱导肝癌细胞凋亡，抑制其增殖。结论川陈皮素对人肝癌细胞SMMC-7721具有明显体外抗增殖作用，对小鼠移植性肿瘤H22亦有一定的抑制作用。