大麦、水稻干旱可诱导LEA基因启动子的克隆及功能分析

论文摘要

干旱和缺水是农业生产面临全球性难题,选育和利用抗旱耐旱品种是节水农业和减缓旱灾最经济的途径。传统育种方法选育抗旱品种受到诸多因素的限制,干旱胁迫分子机制研究和基因工程科技术为品种抗旱性改良提供了新途径。研究干旱胁迫可诱导基因启动子对提高转基因分子育种的效率至关重要,尤其对启动子的评价、选筛、改造和利用子是不可缺少的环节。本研究应用分子克隆和基因瞬间表达等技术,开展了大麦和水稻干旱可诱导LEA基因启动子的分离、克隆和功能分析研究,得到如下结果：1.采用PCR技术,从大麦品种"Sahara"和水稻品种"Jarrah"中克隆到5个LEA基因启动子HVA1s、Dhn4s、Dhn8s、rab16Bj、wsi18j。序列分析表明,5个启动子与原报道的从大麦品种"Himalaya"和"Dicktoo"克隆的HVA1、Dhn4和Dhn8和从水稻品种"Toride"和‘"Josaeng Tongil"克隆的rab16B和wsi18启动子比较,有95.3%～99.8%序列同一性,不同来源的启动子均在序列差异。5个启动子均含数量和类型不同胁迫应答顺式作用。2.为了检测不同启动子及其突变体的瞬时表达水平,构建了15个表达载体。其中GFP表达载体5个,GUS表达载体5个,HVAls启动子ABRE序列碱基替换突变载体3个和DRE/CRT碱基替换突变载体1个,wsi18js启动子ABRE序列碱基替换突变载体1个。3.以大麦幼苗、愈伤组织、部分器官为基因枪转化受体进行基因瞬间表达最佳材料筛选,开展了启动子表达质卡粒基因DNA浓度、表达诱导因子及处理水平等研究,建立了快速检测启动r诱导表达水平和功能分析的定性检测和定量检测方法体系。4.采用干燥、ABA、NaCl、低温等诱导处理,检测对不同启动子瞬间表达的影响。结果显示：①Dhn8s启动子在干燥和ABA诱导及对照处理中,均呈现表达的非特异性,并且表达强度最高,表现为组成型的非特异性启动子。而Dhn4s、HVAls、rab16Bj和wsi18j启动子为诱导型启动子,但诱导表达的强度存在差异,ABA诱导表达强度为Dhn4s> HVA1s> wsi18j> rab16Bj,干燥诱导表达强度为Dhn4s>HVA1s> wsi18j> rab16Bj。②Dhn4s、HVA1s、rab16Bj和wsi18j启动子对低温和NaCl处理诱导的反应均较弱,但存在一定差异。其中HVAls最强,wsi18j较弱,Dhn4s反应弱,rab16Bj没有反应。5. HVAls启动子DRE/CRT序列碱基件换突变研究表明,DRE/CRT序列碱基替换后对ABA和干燥处理诱导的表达水平略有下降（分别降低7.7%和10.9%）,而对低温处理诱导的表达水平下降明显,只相当于野生型的37.9%。说明DRE/CRT主要负责对低温胁迫的应答,但也被ABA和干旱所诱导。6. HVAls启动子中以ACGT为核心序列的ABA应答元件ABRE1、ABRE2和ABRE3序列逐步碱基替换突变研究表明,ABRE3突变后HVAls对ABA和干燥诱导表达水平下降40%-50%；ABRE2和ABRE3同时突变后表达水平下降89%～92%；ABRE1、ABRE2和ABRE3同时突变后表达水平基本同ABRE2和ABRE3同时突变的水平。证实HVAls中的3个ABRE元件中,只有ABRE2和ABRE3具有高效的ABA和干旱胁迫诱导功能,ABRE1不是真正的ABRE顺式调控元件。7. wsi18j启动子ABRE元件碱基替换突变研究显示,在对照中,野生型和突变型的质粒均不表达。经ABA处理后,两者都表达,但突变型启动子表达强度显著减弱,不到野生型的1/4。证实了Wsi18j启动子CE3-ABRE复合体对ABA的应答表达起主要作用。wsi18j与wsi18启动子应答元件分析农明,2个启动子含有的干旱、低温和ABA应答顺式元件的类型和数量完全相同,但对ABA诱导应答有本质的不同。由于碱基的缺失导致wsi18j与wsi18二个启动子的元件间距离改变。碱基差数占相应元件间最大趴离的百分比有明显的差异。CE3与ABRE间相对碱基差最大,为16.67%。Wsi18启动子对ABA反应不敏感,与其ABRE核心基序两侧缺失各1个C碱基并改变CE3-ABRE间的距离有关。8.本研究的创新和价值有：1)拓宽了瞬间表达快速检测干旱可诱导启动子特性方法的应用空间,建立的检测方法一是可应于转基因分子育种的高效启动子筛选；二是可应用于环境胁迫基因调控体系和路径中转录因子的关系和交互作用研究是；三是可应用于启动子顺式作用元件的功能和互作研究；四足可应用于生物信息学预测启动子功能推测的检验。2)在相同背景下客观地比较了LEA基因启动子特性和差异,并对其利用价值进行评价,为利用这些启动子提供了新的试验依据。3)发现LEA基因启动子存在属于非诱导型启动子Dhn8s。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第1章 前言
• 1 干旱对农业生产的限制
• 1.1 世界干旱地区的面积、类型和分布
• 1.2 中国干旱地区的分布与水资源的绝对量不足
• 1.3 节水农业与作物高效用水是克服干旱问题的必然选择
• 2 农作物抗旱育种的研究进展
• 2.1 植物抗旱种质资源的评价和筛选
• 2.2 抗旱育种策略和选择效率研究
• 2.2.1 提高易旱条件下作物产量的育种对策
• 2.2.2 作物抗旱性鉴定技术手段
• 2.2.3 干旱影响产量的生理学基础
• 2.2.4 抗旱相关性状分子标记研究
• 3 植物抗旱基因工程的研究进展
• 3.1 改良转录调控水平的基因工程
• 3.2 改良渗透调节功能的代谢基因工程
• 3.3 保持能量动态平衡的基因工程
• 3.4 增加根系吸水功能的基因工程
• 3.5 抗旱转基因作物的田间试验
• 4 植物干旱可诱导启动子及其表达调控研究进展
• 4.1 启动子的基本特征
• 4.1.1 结构特征
• 4.1.1.1 TATA框
• 4.1.1.2 起始子
• 4.1.1.3 一般上游启动子元件
• 4.1.1.4 特有的上游启动子元件
• 4.1.2 功能分类
• 4.1.2.1 组成型启动子
• 4.1.2.2 组织特异型启动子
• 4.1.2.3 环境诱导型启动子
• 4.2 干旱可诱导启动子表达调控研究进展
• 4.2.1 许多植物基因的表达受环境胁迫调控
• 4.2.2 启动子顺式作用元件具有作为环境胁迫应答开关的功能
• 4.2.3 ABA依赖型基因表达的顺式作用调控元件
• 4.2.3.1 ABRE是最主要的调控元件
• 4.2.3.2 其他ABA依赖型顺式作用调控元件
• 4.2.4 非ABA依赖型基因表达调控元件
• 4.2.4.1 DRE/CRT/LTRE是主要调控元件
• 4.2.4.2 含DRE/CRT元件启动子未必是DREB1A的靶基因
• 4.2.4.3 CBF3/DREB1A上游的顺式作用元件
• 4.2.4.4 其他非生物胁迫顺式作用调控元件
• 4.2.5 不同顺式作用元件间存在交互作用
• 5 论文选题的依据和研究内容
• 5.1 选题依据及意义
• 5.1.1 干旱和缺水是农业生产面临的长期的全球性难题
• 5.1.2 传统育种方法选育抗旱品种受到诸多因素的限制
• 5.1.3 干旱胁迫分子机制研究和基因工程技术为品种抗旱性改良提供新的机会
• 5.1.4 研究干旱胁迫可诱导基因启动子对提高转基因分子育种的效率至关重要
• 5.2 主要研究内容
• 第2章 大麦和水稻干旱可诱导LEA基因启动子克隆
• 1 试验材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法及试剂
• 1.2.1 DNA提取
• 1.2.2 PCR扩增
• 1.2.2.1 引物
• 1.2.2.2 基本反应体系
• 1.2.3 产物提纯和测序
• 1.2.4 构建表达载体和转化细菌
• 1.2.5 启动子表达检测
• 2 结果和分析
• 2.1 启动子片段扩增
• 2.2 启动子片段测序
• 2.2.1 HVA1s启动子序列
• 2.2.2 Dhn4s启动子序列
• 2.2.3 Dhn8s启动子序列
• 2.2.4 rab168j启动子序列
• 2.2.5 wsi18j启动子序列
• 2.3 表达载体构建
• 2.3.1 GFP表达载体
• 2.3.2 GUS表达载体
• 3 讨论
• 3.1 不同品种同源启动子的序列一致性
• 3.2 启动子顺式调控应答元件
• 第3章 快速检测干旱可诱导LEA基因启动子瞬间表达特性的方法建立
• 1 试验材料
• 1.1 试验植物
• 1.2 表达质粒载体
• 1.3 试验仪器
• 1.4 主要试剂
• 2 试验方法
• 2.1 大麦愈伤组织培养
• 2.2 植物幼苗培养
• 2.3 基因枪转化
• 2.3.1 金粉颗粒预处理
• 2.3.2 DNA包被的金粉颗粒制备
• 2.3.3 质粒DNA混合液的制备
• 2.3.4 基因枪转化大麦愈伤组织的准备
• 2.3.5 基因枪转化受体大麦幼苗的准备
• 2.3.6 基因枪轰击
• 2.4 启动子瞬间表达的诱导
• 2.5 瞬间表达及其活性强度检测
• 2.5.1 绿色荧光蛋白的检测
• 2.5.2 GUS染色
• 2.5.3 GFP荧光点/GUS染色点计数定量分析HVA1s启动子表达活性
• 2.5.4 GUS活性/XYN活性测定定量分析HVA1s启动子表达活性
• 2.5.5 GUS和XYN酶活性测定
• 3 结果与分析
• 3.1 启动子在大麦愈伤组织表达
• 3.2 启动子表达的定性检测
• 3.2.1 启动子在不同物种叶片的表达
• 3.2.2 启动子在大麦不同器官和组织中的表达
• 3.3 启动子表达的定量检测
• 3.3.1 启动子表达活性的定量分析
• 3.3.1.1 GFP荧光点/GUS染色点计数定量分析
• 3.3.1.2 GUS活性/XYN活性测定定量分析
• 3.3.2 表达质粒DNA浓度与表达强度
• 4 讨论
• 4.1 鉴定启动子固定表达或诱导表达的特异性
• 4.2 研究启动子结构元件与功能的关系
• 4.3 研究启动子与转录因子和激活因子的关系
• 4.4 研究启动子与诱导因子的关系
• 4.5 鉴定启动子在不同植物上表达的特异性和广谱性
• 第4章 干旱可诱导LEA基因启动子对外界诱导因子的反应
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 基因枪转化
• 1.2.2 瞬间表达诱导和检测
• 1.2.3 幼苗干燥处理相对含水率（RWC）变化测定
• 2 结果和分析
• 2.1 ABA浓度对诱导HVA1s启动子瞬间表达的影响
• 2.2 启动子表达对诱导因子反应的时间动态
• 2.2.1 三种启动子对诱导因子反应的时间动态差异
• 2.2.2 HVA1s启动子在不同诱导因子作用下表达的时间动态
• 2.3 干燥处理对不同启动子表达的诱导作用
• 2.3.1 干燥的诱导作用
• 2.3.2 大麦幼苗干燥处理的相对含水率下降时间动态
• 2.4 ABA处理对不同启动子表达的诱导作用
• 2.5 NaCl处理对不同启动子表达的诱导作用
• 2.6 低温处理对不同启动子表达的诱导作用
• 2.7 不同启动子对干燥和ABA诱导反应表达强度的综合比较
• 3 讨论
• 3.1 发现了可能是非诱导型LEA基因启动子
• 3.2 启动子对诱导处理应答的时间动态存在差异
• 3.3 可诱导启动子的表达强度存在很大差异
• 3.4 顺式应答调控元件与可诱导启动子表达强度的关系
• 第5章 干旱可诱导LEA基因启动子应答元件突变与功能的关系
• 1 材料和方法
• 1.1 试验植物
• 1.2 启动子及其表达质粒载体
• 1.3 PCR扩增引物
• 1.4 方法
• 1.4.1 HVA1s启动子调控应答元件的突变和表达载体构建
• 1.4.1.1 HVA1s启动子DRE/CRT序列的突变和表达载体构建
• 1.4.1.2 HVA1s启动子ABRE3序列的突变和表达载体构建
• 1.4.1.3 HVA1s启动子ABRE2+ABRE3序列的突变和表达载体构建
• 1.4.1.4 HVA1s启动子ABRE1+ABRE2+ABRE3序列的突变和表达载体构建
• 1.4.2 wsi18j启动子ABRE元件的突变和表达载体构建
• 2 结果和分析
• 2.1 DRE/CRT序列的突变对HVA1s启动子应答功能的影响
• 2.2 ABRE序列的突变对HVA1s启动子应答功能的影响
• 2.3 ABRE序列的突变对wsi18j启动子应答功能的影响
• 2.3.1 wsi18j与wsi18启动子应答元件的分析
• 2.3.2 ABRE突变与功能的关系
• 3 讨论
• 3.1 关于HVA1s启动子的结构和功能
• 3.1.1 低温是主导胁迫因子,ABA和干旱胁迫对HVA1s的DRE/CRT元件也产生效应
• 3.1.2 主要依靠ABA路径,非ABA路径也参与HVA1s启动子调控表达
• 3.2 关于wsi18j启动子的结构和功能
• 第6章 结论与展望
• 1 结论
• 1.1 克隆了大麦和水稻干旱可诱导LEA基因启动子
• 1.2 建立了快速检测和分析启动子瞬间表达水平及功能的方法体系
• 1.3 检测和比较分析了不同启动子对ABA、干旱、NaCl、低温等胁迫的应答及其表达水平
• 1.4 分析了启动子主要顺式作用元件碱基替换突变与应答功能的关系
• 2 创新点
• 2.1 拓宽了瞬间表达快速检测干旱可诱导启动子特性方法的应用空间
• 2.2 在相同背景下客观地比较了LEA基因启动子特性和差异
• 2.3 发现了非诱导型LEA基因启动子
• 3 展望
• 3.1 启动子的利用
• 3.2 关于Dhn8s启动子
• 3.3 快速检测干旱可诱导启动子瞬间表达特性方法的应用
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介及在学期间发表出版论著与科研成果