论文摘要
对盐碱地改良利用中,重要而积极的措施之一是提高植物的耐盐能力。随着分子生物学技术的发展,利用基因工程手段提高植物的耐盐性成为了可能。本文以酵母和烟草为模式生物,对柽柳（Tamarix L.）2一Cys Prx基因的抗逆功能进行了初步研究。研究结果如下：（1）利用实时定量RT-PCR技术,对不同胁迫条件下2-Cys Prx基因在柽柳中的时序表达情况进行了分析。结果表明,2-Cys Prx基因能够参与柽柳对PEG、NaHCO3. NaCl、CdCl2胁迫和ABA信号物质的应答。不同胁迫条件下,2-Cys Prx基因的表达模式各不相同。（2）将柽柳2-Cyss Prx基因构建到酵母表达载体pYES2中,重组质粒pYES2-2-Cys Prx转化酿酒酵母INVScl,比较重组和非重组酵母在NaCI、Na2CO3、CuSO4.干旱、CdCl2、53℃高温、-20℃低温、LiCl、ZnCl2、MgCl2和KCI胁迫下的生长状况,研究柽柳2-Cys Prx基因对不同非生物胁迫的抵抗能力。结果表明2-Cys Prx对包括盐、碱、干旱、高温、低温、过氧化物以及重金属在内的多种胁迫具有抵抗能力。（3）为了进一步验证柽柳2-Cys Prx基因在盐和甲基紫精胁迫下的功能,将柽柳2-Cys Prx基因转入烟草。我们选取6个转基因株系进行了NaCl和甲基紫精胁迫试验,分析逆境胁迫条件下非转基因植株和转基因植株的过氧化氢酶（CAT）活性指标的变化。结果显示,在这两种胁迫下,多数转基因株系CAT活性高于非转基因野生型烟草。此外,通过对非转基因株系和转基因株系子代盐胁迫后发芽率和鲜重比较分析,发现大多数转基因烟草的发芽率和鲜重高于非转基因烟草,以上结果表明2-Cys Prx基因的表达提高了转基因烟草的耐盐和抗氧化能力。（4）为探索柽柳2-Cys Prx基因表达的分子机制,将柽柳2-Cys Prx基因构建到Bait载体,利用酵母双杂交系统筛选柽柳cDNA文库中与柽柳2-Cys Prx相互作用的蛋白。共获得了12种可能与2-Cys Prx互作的蛋白。其中7种是未知蛋白,5种是已知蛋白。这5种已知蛋白分别是丙氨酸-乙醛酸转氨酶2、苹果酸脱氢酶、黄酮醇合酶、肽基脯氨酸顺反异构酶和1个扩展蛋白。2-Cys Prx与这些蛋白的互作表明2-Cys Prx可能通过参与光呼吸酶促代谢反应、分解代谢和合成代谢途径、植物细胞壁的延伸和应力松弛以及催化新生肽链的折叠等生物过程提高植物阻挡紫外线辐射、抵御病原菌的侵染能力。但具体过程和机制还有待进一步研究。
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摘要Abstract1 绪论1.1 引言1.2 刚毛柽柳概况1.3 过氧化物酶的研究概况1.4 硫氧还蛋白过氧化物酶基因的研究进展及功能1.4.1 功能1.5 酵母双杂交技术在植物当中的应用1.5.1 酵母双杂交系统的原理1.5.2 酵母双杂交系统在研究中的应用1.6 技术路线2 柽柳2-Cys Prx基因的表达2.1 实验材料2.1.1 植物材料2.1.2 主要试剂2.1.3 溶液配制2.1.4 LB培养基配制2.2 试验方法2.2.1 2-Cys Prx基因的序列分析2.2.2 2-Cys Prx基因的定量PCR2.3 结果与分析2.3.1 柽柳2-Cys Prx基因的生物信息学分析2.3.2 柽柳2-Cys Prx基因在不同非生物胁迫下的表达模式2.4 讨论2.5 本章小结3 柽柳2-Cys Prx基因的酵母转化及抗逆功能分析3.1 试验材料3.1.1 菌种与载体3.1.2 主要试剂3.1.3 主要仪器设备3.1.4 培养基3.2 试验方法3.2.1 酵母表达载体（pYES2-2-Cys Prx）的构建3.2.2 重组质粒（pYES2-2-Cys Prx）和空载体pYES2的酵母转化及鉴定3.2.3 重组酵母INVScl（pYES2-2-Cys Prx）的逆境胁迫试验3.3 结果与分析3.3.1 酵母表达载体（pYES2-2-Cys Prx）的获得及重组子的获得3.3.2 重组酵母INVScl（pYES2-2-Cys Prx）抗逆性的提高3.4 讨论3.5 本章小结4 柽柳2-Cys Prx基因的烟草转化及抗性分析4.1 试验材料4.1.1 菌株和载体4.1.2 主要化学试剂4.1.3 主要仪器设备4.1.4 培养基4.2 试验方法4.2.1 植物表达载体（pROKⅡ-2-Cys Prx）的构建4.2.2 农杆菌感受态的制备及电击转化4.2.3 烟草的遗传转化4.2.4 转化烟草的PCR检测4.2.5 转基因烟草苗的抗性分析4.3 植物表达载体（pROKⅡ-2-Cys Prx）的获得4.3.1 菌液PCR检测4.3.2 阳性质粒测序鉴定4.3.3 重组质粒转化农杆菌的PCR鉴定4.4 转基因植株的获得以及PCR鉴定4.4.1 转基因植株的获得4.4.2 转基因植株的PCR鉴定4.5 转基因烟草的抗性分析4.5.1 胁迫下转基因和非转基因株系的CAT活性比较4.5.2 转基因烟草的逆境胁迫4.6 讨论4.7 本章小结5 2-Cys Prx基因的互作蛋白研究5.1 试验材料5.1.1 菌株和载体5.1.2 主要试剂5.1.3 培养基5.1.4 溶液配制5.2 试验方法5.2.1 酵母双杂交Bait表达载体（pGBKT7-2-Cys Prx）构建5.2.2 Bait蛋白的自激活及毒性检测5.2.3 Bait蛋白（pGBKT7-2-Cys Prx）筛选cDNA文库5.2.4 候选Prey质粒的分离与鉴定5.3 结果与分析5.3.1 构建酵母双杂交Bait表达载体（pGBKT7-2-Cys Prx）5.3.2 确定Bait蛋白无自激活及毒性5.3.3 筛选文库中与Bait（pGBKT7-2Cys-Prx）相互作用的蛋白5.3.4 阳性克隆检测5.3.5 Bait和Prey的进一步互作确认5.4 讨论5.5 本章小结结论参考文献附录攻读学位期间发表的学术论文致谢
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标签：怪柳论文; 硫氧还蛋白过氧化物酶基因论文; 非生物胁迫论文; 耐盐论文; 酵母双杂交论文;
