重组人胸腺素β4（Tβ4）串联体的表达、纯化、鉴定及生物学活性检测

论文摘要

胸腺素β4（Tβ4）最初从胸腺中分离得到,是由43个氨基酸残基组成的多肽,在血小板、创面渗出液、白细胞中浓度最高,体内其它组织中也有分布。胸腺素β4既不是生长因子,也不是细胞因子,然而它作为哺乳动物细胞内一种主要的肌动蛋白调节分子,对受损组织的再生、重塑和愈合起重要的作用。此外,研究证实Tβ4具有多方面生物学活性,参于调节上皮形成、血管生成、抗炎等,因此可促进战创伤的愈合,并可用来治疗感染引起的内毒素性休克及伴随的多器官功能衰竭,在军事医学中具有重要意义。虽然Tβ4有着广泛的应用前景,但由于其分子太小,难于直接在大肠杆菌中表达。目前用于实验室及临床试验的Tβ4多为化学合成品,价格昂贵;而从哺乳动物组织中提取Tβ4,过程复杂而且产量较低,使其应用受到限制,如何以更经济的方法获取此类多肽是本课题要解决的问题。本课题利用大肠杆菌偏爱密码子,合成人Tβ4全长基因,结合PCR技术构建了Tβ4的串联体基因（Tβ4②）,将其克隆入表达载体pET-22b（+）中,重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达后,经盐析、疏水作用层析和离子交换作用层析纯化重组蛋白,最终获得了高纯度的串联体蛋白Tβ4②,并采用Western blot和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF- MS）对其进行鉴定。通过脾淋巴细胞增殖实验测定其活性,结果表明,重组Tβ4②可促进淋巴细胞的增殖与分化,其促进淋巴细胞增殖分化的能力与化学合成品相当。此外,用纯化的Tβ4②蛋白免疫小鼠,ELISA法无法检测到血清中含有抗Tβ4②的抗体,为其在体内发挥生物学效应的奠定基础。我们获得了高纯度的Tβ4②串联体蛋白,它不仅可促进淋巴细胞增殖,而且免疫原性弱,有望成为新型的战伤急救药物。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1 胸腺素β家族
• 4 的生物化学特性'>2 Tβ₄的生物化学特性
• 4 的生理功能'>3 Tβ₄的生理功能
• 4 原核表达的研究'>4 Tβ₄原核表达的研究
• 4 的应用前景'>5 Tβ₄的应用前景
• 正文
• 4②的构建'>实验一 表达载体pET-226（+）-Tβ₄②的构建
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 4②的表达、纯化、鉴定'>实验二 串联体蛋白Tβ₄②的表达、纯化、鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 4②的活性检测'>实验三 串联体蛋白Tβ₄②的活性检测
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 4②的免疫原性鉴定'>实验四 串联体蛋白Tβ₄②的免疫原性鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢