论文摘要
甘草酸为甘草药材的主要有效成分,是判断甘草药材质量的指标之一。自2000年6月国务院明令制止对甘草的掠夺性采挖后,发展人工种植甘草以替代野生甘草,是实现甘草资源可持续利用的根本有效措施。影响栽培甘草中甘草酸含量的因素较多,如种质资源、生长年限、采收时期、产地、土壤、灌溉条件、微环境生态因子等。其中优良品种选育则是保证高质量甘草药材能够可持续利用的关键。随着分子生物学技术在育种领域的渗透,农作物育种研究已深入到分子水平,然而药用植物的分子育种研究仍然很薄弱,瓶颈问题是目前能够直接调控药用植物活性成分含量的优良基因很有限。因此发现调控药用植物活性成分的优良基因成为当前药用植物分子育种亟待解决的关键问题。深入分子水平研究甘草药材中甘草酸含量变化的基因机制,不仅对于优质甘草药材的分子育种具有重要的理论价值和实践意义,对其他药用植物的分子育种及可持续发展亦具有十分重要的借鉴意义。目前对调控药用植物高含量活性成分的优良基因的研究工作以寻找基因组（如RFLP、AFLP、RAPD、ISSR等分子标记技术）差异和单基因（如matK基因、rbcL、ITS序列等）差异与活性成分含量变异的相关性来说明活性成分含量的变异机制。因为无论以基因组还是以单个基因为研究对象,当其和反映活性成分含量的基因同步进化时则均有可能反映出活性成分含量的变异。但若要深入揭示某一活性成分含量的变异机制,对活性成分的功能基因的研究是最直接的方法。因为根据遗传学的基本理论——基因变异可导致基因表达的变异和酶活性的变异,从而导致活性成分含量的变异的分子生物学中心法则,活性成分功能基因序列的差异对活性成分含量的变异有着更直接的调控作用。具体表现为:（1）与活性成分含量相关的功能基因序列多态性很有可能是活性成分含量变异的本源。（2）由于其他基因序列的变异等基因互作现象,功能基因表达量的变化也可能是活性成分含量变异形成的原因之一。因此本文首先通过基于基因组的ISSR分子标记技术初步证实栽培甘草群体中不同个体主根中甘草酸含量的差异是否与种质资源的遗传多样性相关。在此基础上,深入研究甘草酸功能基因之一的鲨烯合酶基因（SQS）的序列多态性、表达差异以综合揭示甘草酸含量变异的分子生物学机制。本文首先将采自密云人工甘草栽培基地的49株实验材料经HPLC法分析,以甘草酸含量相差2%的标准分成高甘草酸含量组和低甘草酸含量组。对其进行了以下四个层面的研究:（1）基于ISSR分子标记技术的遗传多样性及对甘草酸含量变异的影响研究。（2）基于PCR—DNA测序技术的SQS基因序列多态性及对甘草酸含量变异的影响研究。（3）基于Real-Time PCR技术的SQS基因表达量差异及对甘草酸含量变异的影响研究。（4）基于RT-PCR技术的SQS基因的时空表达差异及对甘草酸含量变异的影响研究。以期综合揭示基于基因组ISSR分子标记技术及SQS基因的序列多态性、表达差异的甘草酸含量变异的分子生物学机制。本论文主要结论如下:（1）遗传差异影响甘草酸含量变异。①甘草群体不同个体间存在遗传差异。②ISSR聚类结果显示,多数高甘草酸含量组个体聚成一支,说明高甘草酸含量个体的形成与遗传基础具有明显的相关性;低甘草酸含量组个体并未严格聚成一支,且低甘草酸含量组个体相互遗传距离较大。（2）SQS基因的杂交和突变影响甘草酸含量变异。①甘草群体10个样品的SQS1基因可分为CA、AG及杂交三个核苷酸型;高甘草酸含量个体多为纯合核苷酸型,低甘草酸含量个体多为杂交核苷酸型,推测杂交基因与低甘草酸含量的形成有关。②SQS基因部分外显子的突变是甘草酸含量向极端方向变化的原因,而第一外显子第98碱基处的突变某种程度上可揭示高甘草酸含量形成的基因机制。（3）SQS基因突变及表达量差异影响甘草酸含量变异。①SQS基因表达量可对甘草酸含量变异产生影响。②S SQS1基因对SQS基因表达量起主要贡献作用;不同外显子的基因突变联合与SQS基因低表达量的形成有关。（4）SQS1基因表达量差异影响不同部位和月份甘草酸含量变异。不同部位与不同月份SQS基因表达与否与甘草酸含量积累有关:①5月份甘草叶及根组织中SQS基因均大量表达。②甘草叶组织中,SQS1基因仅在5月份出现大量表达,而在8月、9月、10月、11月、12月、1月均未见该基因的表达;不同月份甘草主根中SQS基因表达量与甘草酸含量呈正相关趋势:甘草根组织中,5月、8月、9月、10月SQS1基因表达量与甘草酸含量呈正相关趋势。综上所述,栽培甘草群体中存在遗传变异现象;且SQS基因序列变异、表达量变异均对甘草酸含量变异产生影响。但SQS基因的序列差异和表达差异在甘草酸含量变异中的贡献率还需进一步研究。本论文的创新之处如下:（1）甘草酸含量变异,尤其栽培后甘草药材中甘草酸含量降低的问题是甘草可持续发展的瓶颈。中药研究者已经从产地、采收、栽培技术等方面对甘草酸含量的变异机制进行了研究,本文从分子生物学角度探讨了甘草酸含量变异的机制,并获得初步结果。（2）在从分子水平探讨甘草酸含量变异的机制时,本论文选择甘草酸功能基因之一的SQS基因,从SQS基因的序列多态性以及表达量差异两个层面综合阐释甘草酸含量变异的机制,并获得初步结果。（3）目前对中药材中基因与活性成分含量变异的相关性研究,集中于从基因组差异及单个基因角度探讨。本文在基于基因组差异的ISSR遗传多样性分析基础上,又深入到功能基因层面,将二者结合以期揭示甘草酸含量变异的机制,并获得初步结果。本文研究结果对甘草选种、分子育种提供了依据,具有一定的科学意义和实用价值。