TGEV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其S蛋白抗原位点的原核表达

论文摘要

猪传染性胃肠炎（Porcine transmissible gastroenteritis，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的一种以一周龄以下仔猪呕吐、水样腹泻和高死亡率（通常为100％）为主要特征的传染病。该病是一种世界性的疾病，给畜牧业生产带来巨大的经济损失。由丁它主要引起一周龄以下仔猪几乎100％死亡，所以及早的确诊对该病的防治就具有特别重要的意义，因此建立一种快速、高灵敏度的诊断方法对防治TGE是十分必要的。而传统的检测方法都不能满足特定要求，荧光定量PCR技术的出现解决了这一难题。本研究根据猪传染性胃肠炎病毒N基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针，RT-PCR扩增得到目的基因，并克隆到pMD18-T载体得到阳性质粒，用分光光度计对质粒定量，10倍梯度稀释即为质粒标准品。通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对60份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒（免疫层析法）比较。结果，该方法的检测敏感性达到15拷贝／μl，且具有很好的特异性和重复性，而常规RT-PCR方法只能检测到1.53×103拷贝／μl。对现地病料的检测结果也表明该法比常规RT-PCR方法和TGEV抗原快速检测试剂盒的敏感性高。猪呼吸道冠状病毒（Porcine respiratory coronavirus，PRCV）是TGEV的基因缺失变异株，PRCV和TGEV核苷酸序列比较同源性达96％。由于TGEV和PRCV基因组结构十分相似，抗原有相关性，产生的中和抗体有交叉反应，因此多克隆抗体等血清学方法很难将二者区分开。PRCV与TGEV相比，其S基因N末端有大量碱基缺失，不同的PRCV毒株其碱基缺失情况也各不相同，有621～681个碱基不等的缺失，并导致PRCV失去两个抗原位点。本研究根据已发表的PRCV基因组序列（GenBank登陆号：DQ811787）中的S基因序列和本实验室测定的TGEV华毒弱毒株的S基因序列进行比对分析，用一对特异性引物对PRCV S基因缺失区域即TGEV S蛋白的B和C抗原位点（91～513nt）进行扩增，扩增后的片段克隆到pET30a（+）表达载体进行原核表达。SDS-PAGE结果表明，目的蛋白成功表达，且蛋白表达量很高，占菌体总蛋白的45.4％。Western blot分析结果表明目的蛋白具有很好的免疫学活性。本研究成功的高效表达了TGEV S蛋白B、C抗原位点多肽，为TGEV和PRCV的血清学鉴别诊断，或用于制备特异性单克隆抗体以区分TGEV和PRCV等奠定了重要的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
• 1.1 猪传染性胃肠炎概述
• 1.1.1 病原
• 1.1.2 病毒生长培养特征
• 1.2 TGEV分子生物学研究进展
• 1.2.1 基因织结构
• 1.2.2 TGEV蛋白结构与功能
• 1.2.3 TGEV的组织嗜性
• 1.3 TGEV分子生物学诊断方法研究进展
• 1.3.1 核酸探针杂交技术检测 TGEV
• 1.3.2 聚合酶链式反应检测 TGEV
• 1.3.3 TGEV与 PRCV的鉴别诊断方法
• 1.3.4 展望
• 1.4 荧光定量 PCR技术研究进展
• 1.4.1 荧光定量 PCR定量原理
• 1.4.2 常用的荧光定量 PCR仪
• 1.4.3 荧光探针的种类及其作用原理
• 1.4.4 荧光定量 PCR技术的优点
• 1.4.5 荧光定量 PCR技术的应用
• 1.5 研究的目的和意义
• 第二章 TaqMan荧光定量 RT-PCR检测 TGEV方法的建立与应用
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒与细胞
• 2.1.2 病料
• 2.1.3 载体与受体菌
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.1.6 引物与探针
• 2.2 方法
• 2.2.1 病毒的增殖
• 2.2.2 电镜观察
• 50)的测定（Reed-Muench法）'>2.2.3 TGEV组织培养半数感染量(TCID₅₀)的测定（Reed-Muench法）
• 2.2.4 病毒 RNA及内参基因组的提取
• 2.2.5 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 2.2.6 PCR产物鉴定及纯化回收
• 2.2.7 PCR产物连接与转化
• 2.2.8 重组质粒提取、鉴定及序列测定
• 2.2.9 质粒浓度测定
• 2.2.10 荧光定量PCR的各种反应条件和参数摸索
• 2.2.11 标准曲线的建立
• 2.2.12 敏感性试验
• 2.2.13 特异性试验
• 2.3.14 重复性试验
• 2.2.15 现地病料的检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 电镜观察
• 50的测定'>2.3.2 TCID₅₀的测定
• 2.3.3 TGEVN基因与β-actin基因目的片断的PCR扩增
• 2.3.4 重组质粒pMD-TGEVN和pMD-actin的构建与鉴定
• 2.3.5 重组质粒浓度的测定
• 2.3.6 荧光定量 RT-PCR反应条件的优化
• 2.3.7 标准曲线的建立
• 2.3.8 敏感性试验
• 2.3.9 特异性试验
• 2.3.10 重复性试验
• 2.3.11 现地病料的检测
• 2.4 讨论
• 第三章 TGEV S基因抗原位点的原核表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 病毒
• 3.1.2 菌体和载体
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 引物
• 3.2 方法
• 3.2.1 目的基因的获得
• 3.2.2 重组表达质粒的构建
• 3.2.3 重组蛋白诱导表达及条件优化
• 3.2.4 重组蛋白的纯化
• 3.2.5 Western Blot检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 目的基因的获得
• 3.3.2 重组质粒的 PCR鉴定
• 3.3.3 重组蛋白的表达鉴定及条件优化
• 3.3.4 重组蛋白的纯化
• 3.3.5 Western blot分析
• 3.4 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 攻读硕士期间发表的学术论文