应用重组MSG1蛋白检测猪附红细胞体抗体的ELISA方法的建立及其单克隆抗体的制备

论文摘要

猪附红细胞体（Mycoplasma suis, M.suis）是一种寄生于猪红细胞表面、血浆及骨髓中的微生物，能够引起猪的发热、贫血、黄疸等临床症状的人畜共患性传染病。鉴于临床猪附红细胞体病造成的巨大的经济损失，对于猪附红细胞体研究成果向实践转化的需求显得尤为迫切。其中对MSG1蛋白的研究相对较多，将其作为研究对象较为合适，于是确定了本课题研究思路。采用人工构建的重组大肠杆菌进行MSG1蛋白的体外表达，对蛋白在大肠杆菌BL21菌株的表达情况进行了初步分析；随后将此蛋白作为检测抗原建立ELISA方法进行临床猪附红细胞体病的检测，并设立了敏感性试验、特异性试验、符合性试验和重复性试验，对建立的ELISA方法进行有效性评估；最后将MSG1蛋白接种小鼠，建立杂交瘤细胞系，筛选阳性克隆，获取单克隆细胞株，进行单克隆抗体的生产。通过试验，发现猪附红细胞体MSG1蛋白在BL21菌株表达系统能以包涵体的形式进行大量表达，并且获得了纯化MSG1蛋白；MSG1蛋白有良好的抗原性，以MSG1蛋白建立的ELISA方法用于临床检测猪附红细胞体病感染率为46.25%，其中阳性样本对已知小鼠抗血清有明显的阻断作用，并且与其他一些抗原无交叉反应，此ELISA方法的特异性和敏感性分别可达到97.06%和95.92%，较间接血凝试验(IHA)有更高的检出率；通过建立的杂交瘤技术，获得了两株能稳定分泌抗体的单克隆细胞系。本试验的成果为进一步研究MSG1蛋白奠定了基础，为猪附红细胞体病的诊断提供了方法和手段，为进一步建立更快、更直观、更简便的检测方法提供了物质基础和依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 附红细胞体病原学
• 1.1.1 种属分类
• 1.1.2 形态特征
• 1.1.3 培养特性
• 1.1.4 理化特性
• 1.2 附红细胞体病流行病学
• 1.2.1 附红细胞体病的流行概况
• 1.2.2 生活史和传播途径
• 1.3 致病机理
• 1.4 猪附红细胞体病的诊断
• 1.4.1 临床诊断
• 1.4.2 实验室诊断
• 1.5 猪附红细胞体病的防治
• 1.6 目前关于猪附红细胞体的分子生物学研究
• 2 材料与方法
• 2.1 菌种
• 2.2 细胞
• 2.3 实验动物
• 2.4 主要试剂与材料
• 2.5 常用缓冲液及仪器设备
• 2.6 MSG1 蛋白的诱导表达及鉴定
• 2.6.1 重组菌株的复苏、纯化与克隆
• 2.6.2 MSG1 蛋白的诱导表达
• 2.6.3 表达产物的 SDS-PAGE 检测
• 2.6.4 蛋白表达形式的鉴定
• 2.7 目的蛋白的纯化与浓度测定
• 2.7.1 MSG1 蛋白的纯化
• 2.7.2 纯化蛋白的含量测定
• 2.8 多克隆抗体的制备
• 2.8.1 免疫程序的制订
• 2.8.2 免疫动物的选择
• 2.8.3 免疫原的制备
• 2.8.4 抗体效价的检测
• 2.8.5 多克隆抗体的收集与保存
• 2.8.6 MSG1 蛋白与多克隆抗体的 Western blot 检测
• 2.9 ELISA 检测方法的建立
• 2.9.1 重组蛋白 ELISA 方法的检测程序
• 2.9.2 最适反应条件的摸索
• 2.9.3 重组蛋白 ELISA 判定标准的确定
• 2.9.4 特异性试验
• 2.9.5 敏感性与特异性检测
• 2.9.6 临床样本检测的符合性试验
• 2.9.7 重复性试验
• 2.10 杂交瘤细胞系的建立
• 2.10.1 骨髓瘤细胞的准备
• 2.10.2 脾细胞的准备
• 2.10.3 细胞融合
• 2.10.4 融合细胞的培养和筛选
• 2.10.5 阳性细胞株的亚克隆
• 2.10.6 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性分析
• 2.10.7 两株单克隆细胞的鉴别
• 2.11 单克隆抗体的制备
• 3 结果
• 3.1 MSG1 蛋白诱导表达鉴定与纯化
• 3.1.1 MSG1 蛋白最佳表达时间的确定
• 3.1.2 MSG1 蛋白表达形式的鉴定
• 3.1.3 纯化蛋白的 SDS-PAGE 结果
• 3.2 多克隆抗体的制备结果
• 3.2.1 多克隆抗体的效价
• 3.2.2 MSG1 蛋白与多抗的 Western blot 检测结果
• 3.3 ELISA 检测方法的建立结果
• 3.3.1 最适作用条件的确定
• 3.3.2 临床样本的检测结果
• 3.3.3 特异性试验结果
• 3.3.4 敏感性与特异性检测
• 3.3.5 符合性试验结果
• 3.3.6 重复性试验结果
• 3.4 杂交瘤细胞系的建立结果
• 3.4.1 细胞融合率
• 3.4.2 杂交瘤细胞株的建立及分泌抗体的稳定性
• 3.4.3 两株单克隆细胞株的鉴别结果
• 3.5 单克隆抗体的制备结果
• 4 讨论
• 4.1 MSG1 蛋白在 E. coli BL21 中的表达
• 4.2 MSG1 蛋白的抗原性
• 4.3 建立的 ELISA 方法的有效性
• 4.4 制备的单克隆抗体的潜在应用价值
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 附录常用试剂的配制
• 8 致谢
• 9 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录及著作