PPARγ激动剂吡格列酮减轻大鼠创伤性脑损伤胶质反应及神经保护作用的研究

论文摘要

创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）是临床上一种严重的致残性疾病,其死亡率和致残率极高,且目前尚没有理想的治疗措施,因此研究创伤性脑损伤的发病机制及寻求有效的治疗药物和措施具有重要的理论意义和医疗价值。创伤性脑损伤除了原发性神经损伤外,还可通过炎症反应、谷氨酸兴奋性毒性作用、自由基生成和脂质过氧化、离子失衡、细胞凋亡等多种互相关联的病理机制导致脑损伤区周围更广泛的神经元继发性死亡,其中炎症反应是TBI后继发性神经损伤的关键因素,是影响神经细胞存活和功能恢复的重要因素。脑损伤时中枢神经系统活化的小胶质细胞数量反应脑损伤后炎性反应程度。大量活化的小胶质细胞可通过释放炎性细胞因子、神经毒性物质等直接或间接地引起神经元死亡。星形胶质细胞（astracyte, AST）的活化对神经元损伤具有双重作用。AST适当的活化,通过合成和分泌神经生长因子、神经营养因子,清除自由基,保持机体自身稳态等,发挥神经保护及修复作用；而过度活化的AST可释放Interleukin（IL）、Tumor necrosis fzctor（TNF）、Interferon（INF）、nitric oxide（NO）等炎性因子,氧自由基和细胞毒性物质,引起脑组织炎症反应,直接或间接诱发神经元死亡。过度增生的胶质细胞形成胶质瘢痕对神经元轴突和髓鞘的再生构成结构和功能上的障碍。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARy）是配体激活的细胞核激素受体超家族成员转录因子,通过调节目的基因的转录发挥重要作用。PPRγ时激动剂吡格列酮（pioglitazone, pio）作为有效的噻唑烷二酮类（thiazolidinediones, TZDs）药物,能够改善胰岛素抵抗,控制血糖水平,而且没有显著的细胞毒性和并发症,已被美国食品药品管理局（FDA）批准作为2型糖尿病治疗用药。PPARγ激动剂还可通过抑制核转录因子Nuclear factor-κB （NF-κB）、转录活化因子JAK-STAT信号通路来减少TNF-a, IL-1β和INF-γ等炎性细胞因子的释放,从而减轻组织炎症反应。最近研究表明在急性中枢神经系统损伤如脑缺血和脊髓损伤的动物模型上,TZDs类药物即可通过抑制小胶质细胞活化、星形胶质细胞增生以及许多炎症趋化因子、细胞因子、粘附分子的释放,同时又可促进神经保护基因如热休克蛋白的表达,从而发挥神经保护作用。另有大量证据表明PPARγ在中枢神经慢性疾病,如阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,, AD），多发硬化（multiple sclerosis, MS）,帕金森病（Parkinson’s disease, PD）的治疗中具有抗炎作用。目前,关于脑损伤后神经修复分子机制和功能恢复治疗的研究是医学研究的难点和热点,鉴于最新研究表明吡格列酮对脑缺血损伤后具有减轻炎性反应等神经保护作用,所以我们对大鼠TBI后吡格列酮抗炎效应进一步研究具有重要的理论意义。本工作在整体水平上利用可控性大鼠脑皮层损伤（Controlled Cortical Impact, CCI）动物模型,研究了PPARγ激动剂吡格列酮对TBI大鼠脑皮层损伤体积、小胶质细胞炎性反应、星形胶质细胞活化程度以及神经元形态和数量表达的影响；在细胞水平上观察了脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的新生大鼠皮层神经细胞毒性变以及吡格列酮的神经细胞保护作用,并初步探讨其可能的作用机制。主要研究内容：1.吡格列酮减少TBI大鼠脑皮层损伤区的体积本实验采用CCI方法制备大鼠左侧顶叶脑皮层损伤实验模型,利用Neutralred染色及大鼠皮层损伤区体积检测的方法,观察分析了pio对TBI大鼠损伤皮层损伤区体积的影响。实验分四组,即假手术组（sham组）；TBI后溶剂处理组（vehicle+TBI组）：TBI后同sham组给予等量溶剂：TBI后pio治疗组（pio+TBI组）；TBI后pio加PPAR7拮抗剂组（pio+T0070907+TBI组）。结果发现各实验组大鼠在CCI损伤后第15d脑皮层损伤区形成不同程度的空洞。脑皮层损伤区体积测定的结果显示pio治疗组大鼠TBI皮层损伤体积为2.21±0.94mm3,与TBI损伤组（5.51±2.11 mm3）和pio拮抗剂组（4.54±1.72 mm3）相比均显著减少（P<0.05）。提示pio能够通过PPARγ显著减少了TBI大鼠脑皮层损伤区的体积,发挥神经修复的作用。2.吡格列酮减轻大鼠脑皮层损伤周围区小胶质细胞的活化为探讨吡咯列酮对TBI大鼠损伤皮层神经结构修复作用是否通过减少小胶质细胞过度增殖活化导致的炎性反应所引起,本实验采用OX-42免疫组化染色方法观察了各实验组大鼠TBI后小胶质细胞活化程度和数量变化。结果发现在大鼠CCI损伤后第15d,正常对照组和其他实验组大鼠正常脑皮层OX-42染色较浅,形态学表现为细胞数目少、分布稀疏、胞体小、突起细短；而TBI损伤组和pio拮抗剂组大鼠脑皮层损伤周围区OX-42蛋白染色明显增强,细胞数目增多,胞体增大,突起增粗,呈现活化的小胶质细胞形态学特征。TBI损伤组大鼠皮层损伤周围区每个视野中激活的小胶质细胞数目较正常对照组明显增加（P<0.05）；pio治疗组大鼠皮层损伤周围区激活小胶质细胞的数量比TBI损伤组和pio拮抗剂组均显著减少（P<0.05）。提示大鼠CCI损伤引起皮层损伤周围区小胶质细胞大量活化增殖,pio能够减少小胶质细胞的过度活化,PPARγ阻断剂可逆转pio对小胶质细胞的抑制效应。3.吡格列酮减轻大鼠皮层损伤周围区星形胶质细胞的反应本实验在CCI所致大鼠TBI实验模型上,应用GFAP免疫组化染色和计数的方法,观察了Pio及其阻断剂对TBI大鼠皮层损伤区周围星形胶质细胞的反应。结果发现大鼠CCI损伤后第15d,正常对照组大鼠和其它各实验组健侧顶叶脑皮层GFAP蛋白表达较少,星形胶质细胞数量少、分布稀疏、胞体较小、突起较细,呈星芒状；TBI损伤组和pio拮抗剂组大鼠皮层损伤周围区GFAP蛋白表达明显增强,表现为细胞数量增多,胞体增大,突起增粗,呈现活化状态,并且在损伤空洞的边缘形成了明显的胶质瘢痕。TBI组大鼠皮层损伤周围区每个视野激活的星形胶质细胞数量较正常对照组明显增加（P<0.05）,而pio治疗组比TBI损伤组和pio拮抗剂组均显著减少（P<0.05）。提示pio可以通过PPARγ抑制星形胶质细胞增殖活化,减少GFAP蛋白表达和胶质瘢痕的形成。4.吡格列酮对大鼠脑皮层损伤周围区神经元的保护效应中枢神经系统的活动最终取决于神经元的结构和功能。为确定吡格列酮能够通过抗炎作用,减少损伤皮层神经元的继发性损伤,发挥神经保护作用。本实验在CCI大鼠顶叶皮层损伤动物模型的基础上,利用NeuN免疫组化和细胞计数的方法,研究了吡格列酮及其阻断剂对大鼠TBI后15d皮层损伤周围区神经元形态及数量变化的影响。结果发现正常对照组大鼠神经元排列整齐,形态正常,NeuN蛋白表达较强；TBI损伤组大鼠皮层损伤区已形成空洞,神经元消失,而皮层损伤周围区NeuN蛋白表达减少,神经元排列稀疏,胞体缩小,部分突起断裂,残留的神经元萎缩,神经元数目较正常对照组明显减少（P<0.05）。而pio治疗组大鼠皮层损伤区周围神经元形态完整,NeuN蛋白表达较TBI损伤组加强,细胞胞体呈椭圆形,突起较长。神经元数量较TBI损伤组和pio拮抗剂组均明显增多（P<0.05）。提示pio可通过PPARγ促进TBI大鼠脑皮层损伤周围区神经元损伤的修复和存活。5.LPS致体外培养新生大鼠脑皮层神经细胞死亡的剂量依赖性以及吡格列酮的神经细胞保护效应为从细胞水平探讨吡咯列酮的抗炎作用及其神经元保护作用机制,本工作利用倒置显微镜观察、活细胞计数和NSE免疫细胞化学方法,观察了不同浓度LPS溶液对体外培养的新生大鼠皮层神经细胞的存活生长的影响以及吡咯列酮对其的作用。结果发现正常对照组新生鼠大脑皮层神经细胞生长到第5d,其胞体饱满,边界清晰,周围有光晕,有2-3个突起,细胞间突起形成网状连接。用1μg／mL、10μg/mL、20μg/mL 100μg/mL LPS溶液分别处理细胞48h,发现1μg／ml LPS组细胞生长状况与对照组比较无明显差异；10μg/mL LPS组活细胞数量减少,细胞体积缩小,突起断裂,细胞之间突触连接减少；100μg/mL LPS组可见大量的死亡细胞碎片,几乎无存活的神经细胞。10、20, 100μg/ml LPS组活细胞计数与对照组比较,细胞数量明显减少,存在显著性差异（P<0.01）。NSE阳性神经元免疫组化染色发现随LPS溶液浓度的增加神经元数量呈浓度依赖性减少,10、20、100μg/mL LPS组神经元数量与对照组比较,存在显著性差异（P<0.01）。用pio（10μmol/L）和LPS （10μg/mL）溶液共同作用于新生大鼠皮层神经细胞48h后,与10μg/mL LPS组比较,活细胞计数和NSE阳性细胞计数的细胞数量均显著增加（P<0.01）。提示LPS溶液呈剂量依赖性地导致体外培养的新生大鼠皮层神经细胞死亡,pio可以部分阻断LPS诱导的皮层神经细胞死亡。6.吡咯列酮减轻LPS所致的体外培养的新生鼠大脑皮层神经细胞的凋亡本实验利用Hoechst333258荧光免疫细胞化学染色的方法,探讨LPS诱导体外培养的新生大鼠皮层神经细胞死亡的性质以及吡咯列酮的神经细胞保护作用。结果发现正常对照组细胞核呈朦胧蓝色荧光,而10μg/ml、20μg/ml. 100μg/ml LPS溶液作用于培养至第五天的新生大鼠皮层细胞48h后,细胞核呈现亮而致密的蓝色荧光,凋亡细胞的数量呈LPS溶液剂量依赖性增加,与对照组比较差异非常显著（P<0.01）。Pio （10μmol/L）+LPS溶液组凋亡细胞的数目明显减少,与10μg/ml LPS溶液组比较差异显著（P<0.01）。提示LPS可以诱导培养的新生大鼠皮层神经细胞凋亡,Pio可以部分阻断LPS诱导的新生鼠大脑皮层神经细胞凋亡。结论：1.大鼠TBI皮层损伤后由于神经细胞原发和继发性损伤,在损伤区形成了空洞。Pio治疗可以显著减少皮层损伤体积和神经元数目的丢失,增强了损伤脑组织神经元的存活和修复作用。T0070907治疗可对抗pio对脑组织的保护作用。2.大鼠TBI皮层损伤后损伤皮层周围区小胶质细胞和星形胶质细胞过度增殖活化和胶质瘢痕形成。Pio治疗显著减少损伤皮层周围区小胶质细胞和星形胶质细胞的过度增殖活化,发挥抑制损伤脑组织炎性反应的作用。T0070907治疗可对抗pio抑制脑组织炎性反应的作用。3.LPS呈剂量依赖性地导致体外培养的新生大鼠皮层神经细胞死亡,Pio可以部分阻断LPS诱导的皮层神经细胞死亡。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 第一部分 吡格列酮减少大鼠创伤性脑损伤后的神经损伤和胶质反应材料和方法
• 一、材料与方法
• 二、实验结果
• 讨论
• 第二部分 吡格列酮减轻LPS诱导的体外培养新生鼠大脑皮层神经细胞死亡材料和方法
• 一、材料与方法
• 二、实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 论文附图
• 综述
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表