香菇分子遗传图谱构建和数量性状座位（QTL）分析

论文摘要

本研究对香菇与产量、品质密切相关的若干重要数量性状及其相互关系进行了较系统的遗传分析。同时以野生香菇菌株HW21的131个孢子单核体为作图群体,构建了包括RAPD、ISSR、SRAP和SSR标记在内的第一张香菇混合分子标记遗传连锁图谱,并对香菇双核体和单核体的主要数量性状进行了QTL定位研究,主要结果如下:1.以采自湖北省神农架国家自然保护区腹地的野生香菇菌株HW21为亲本双核体,用常规交配试验及OWE-SOJ技术、核迁移试验等对其所产生的238个担孢子的交配型进行了准确鉴定,从中选取分属于A1B1、A2B2、A1B2和A2B1等4种基本交配型的113个担孢子及属于次级重组体的18个担孢子,构建了一个总数为131个孢子单核体的规模较大、遗传多样性较为丰富的作图群体。同时还选取2个野生菌株、2个栽培菌株的原生质体单核体或孢子单核体作为测交单核体,与作图群体的孢子单核体交配,获得了4个系列的测交双核体,为后续的数量性状的遗传分析、分子连锁遗传图谱的构建和QTL定位分析等工作的开展奠定了良好的基础。2.对香菇双核体的鲜菇产量、单菇鲜重等17个数量性状进行了表型、遗传及环境的相关分析和主成分分析。由相关分析结果可知,单菇鲜重与有关单菇的其他5个性状在表型、遗传和环境等3个方面都存在极显著的正相关,与菇数存在3种极显著的负相关,与CMC酶活性、木聚糖酶活性分别呈显著和极显著遗传负相关。鲜菇产量与出菇期和原基期呈极显著的表型和遗传负相关,与菇数、两种菌丝生长速度及菇盖厚度呈极显著的遗传正相关。主成分分析结果表明,17个性状可以缩减为6个主成分,按方差贡献率大小分别命名为单菇、发育、产量、酶活、原基和转色因子,6个主成分的方差累积贡献率为80.23%。对单核体的菌丝长速、胞外酶活性等11个性状进行相关分析发现,单核体两种菌丝长速和抗木霉活性三个性状之间存在显著或极显著表型和遗传正相关;CMC酶活性与漆酶活性之间存在极显著表型和遗传正相关;漆酶活性与愈创木酚氧化酶活性之间也存在极显著表型和遗传正相关;两种菌丝长速与与漆酶和愈创木酚氧化酶之间有极显著遗传和表型负相关;菌丝密度、整齐度和长势之间存在极显著正相关;色素有无与菌丝整齐度、长势之间有极显著负相关,与菌丝密度无显著性相关关系。3.从真菌基因组计划网站（FGP）和NCBI网站数据库下载了符合条件的总长度为8.1×106 bp的11,150条香菇的EST（包括10条cDNA）序列,通过SSRhunter 1.3软件结合手工查找,从中发现2.83%即316条EST含有一共469个SSR,平均每17.3kb出现一个EST-SSR。在所有EST-SSR中,三碱基和六碱基SSR出现最多,分别占EST-SSR总数的38.00%和20.00%。出现较多的基序为（A）n、（T）n、（GA）n、（AG）n、（TGA）n、（GAT）n和（TCTTT）n,占所有EST-SSR的35.39%。基于香菇EST数据库中的SSR序列,按照引物设计指标,利用Oligo6.0软件,一共设计了87对香菇SSR引物,有67对可以扩增出清晰可见的谱带,有效引物占77.0%。扩增的谱带总数为90条,平均每对引物扩增1.34条谱带。67对引物中有36对可以在双亲和子代中扩增出有多态性的谱带41条。4.选取277个符合1:1分离的标记通过MapMaker 3.0软件构建了香菇混合分子标记遗传图谱,图谱中包括94个RAPD标记、53个ISSR标记、104个SRAP标记、16个SSR标记及2个交配型座位MatA、MatB。构建的连锁图分为14个连锁群,覆盖基因组总长度2944.1cM,平均每条连锁群覆盖长度210.3cM。整体来看,标记的分布较为均匀,相邻分子标记间平均图距为10.7cM,图距最小的是LG10中SSR标记F107400与F33170之间的距离,为0.4cM;最大的是LG8中RAPD标记S471290与S421400之间的距离,为36.8cM。连锁图中一共出现16个距离大于20cM的间隙。5.利用Winqtlcart 2.5软件中的复合区间作图法（CIM）对香菇30性状进行检测,以置换测试法确定不同性状的显著性阀值,在本研究构建的香菇遗传图谱中定位了28个性状的78个QTL。另外有4个QTL的LOD值≥2.5,但未等于或超过显著性阀值。各性状中检测出的QTL多数在1～4个之间,发现QTL最多的性状是单核体菌丝长速（PDA培养基）Mo-MGRP,一共发现8个QTL。14条连锁群中,除了LG9、LG12、LG13和LG14没有被检测到QTL外,其他连锁群均检测到数目不等的QTL,其中LG3中检测到的最多。QTL分布不均匀,主要集中在连锁群LG1、LG2、LG3和LG8上。检测出的QTL中有59个成簇分布,占全部QTL的72.0%,成簇分布QTL所控制的性状基本上都存在显著或极显著相关性。单个QTL的贡献率在6.95～63.66%之间,平均贡献率为17.29%,其中超过20%的主效QTL有23个,占全部OTL的28.05%。QTL的长度（95%置信区间）在2.8～28.7cM之间,平均11.02cM。用Qtlnetwork 2.0软件中的Bayesian-MCMC作图方法对香菇30个性状的QTL进行了分析以验证CIM方法发现的QTL,检测出17个性状的26个QTL,除少数几个性状的QTL外,其他QTL全部被CIM法检测到,而且,二者共同发现的QTL具有基本相同的标记区间、在连锁群上的位置以及相差不大的QTL长度、贡献率和加性效应。通过MCMC方法对香菇全基因组扫描,发现有4个性状存在6对上位性互作的QTL,贡献率在3.58～36.84%之间,平均为18.65%。总体上看,本研究构建的香菇分子遗传图谱与其他学者构建的香菇遗传图谱相比,具有作图群体数量和分子标记数量多、图谱覆盖基因组长、采用了新型标记ISSR、SRAP及SSR等特点,并且基于该图谱在国内外首次定位了有关香菇双核体和单核体的主要数量性状的QTL。

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摘要

ABSTRACT

缩略词表

第一章文献综述

1 大型真菌分子遗传图谱构建和QTL定位研究进展

1.1 真菌分子遗传图谱构建原理和方法

1.1.1 遗传图谱构建的理论基础

1.1.2 图谱构建的基本步骤

1.1.3 分子遗传图谱常用标记

1.1.4 真菌遗传作图群体的选择

1.2 大型真菌遗传图谱构建概况

1.2.1 灰盖鬼伞（Coprinus cinereus）

1.2.2 双孢蘑菇（Agaricus bisporus）

1.2.3 糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus var.Florida）

1.2.4 香菇（Lentinula edodes）

1.3 大型真菌QTL定位方法

1.3.1 单标记分析法

1.3.2 区间作图法

1.3.3 复合区间作图法

1.3.4 混合线性模型的复合区间作图法

1.3.5 Bayesian-MCMC（Bayesian-Markov chain Monte Carlo）作图方法

1.3.6 其他QTL定位方法

1.3.7 QTL精细定位

1.4 大型真菌OTL定位研究进展

1.4.1 双孢蘑菇QTL定位研究

1.4.2 糙皮侧耳QTL定位研究

2 香菇遗传与育种研究进展

2.1 香菇概述

2.2 香菇遗传研究进展

2.2.1 香菇的生活史

2.2.2 香菇交配型研究进展

2.2.3 香菇子实体发育相关基因的研究

2.2.4 香菇数量性状的研究

2.2.5 香菇遗传多样性的研究

3 本研究目的和意义

第二章作图群体的构建

1 引言

2 材料与方法

2.1 供试香菇材料

2.2 供试培养基

2.3 试验所用仪器、设备

2.4 试验方法

2.4.1 作图群体构建

2.4.2 测交双核体菌株的制备

3 结果与分析

3.1 作图群体单核体亲本与测交单核体之间交配型的分析

3.2 作图群体单核体交配型分析及作图群体数量的确定

3.3 测交双核体的获得

4 讨论

4.1 香菇孢子单核体交配型鉴定

4.2 作图群体单核体与测交单核体之间交配型的鉴定

4.3 香菇次级重组交配型

5 小结

第三章香菇重要数量性状及其相互关系的遗传分析

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.2.1 双核体栽培及农艺性状

2.2.2 单核体菌丝密度、整齐度及长势测定

2.2.3 菌丝长速测定

2.2.4 抗木霉活性测定

2.2.5 胞外酶活性测定

2.3 数据处理

3 结果与分析

3.1 测交双核体部分性状的相关分析和主成分分析

3.1.1 性状间的相关分析

3.1.2 主成分分析

3.2 单核体数量性状的分析

3.2.1 单核体几种数量性状的相关性分析

3.2.2 单核体菌丝密度、整齐度、长势与其他性状的相关性分析

4 讨论

4.1 双核体部分性状的相关分析和主成分分析

4.2 单核体数量性状的分析

5 小结

第四章分子连锁遗传图的构建

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 主要试剂的来源、规格及用途

2.3 试验所用仪器、设备

2.4 试验方法

2.4.1 基因组DNA提取

2.4.2 RAPD引物扩增分析

2.4.3 ISSR引物扩增分析

2.4.4 SRAP引物扩增分析

2.4.5 SSR引物扩增分析

2.4.6 扩增产物检测

2.4.7 遗传图谱构建

3 结果与分析

3.1 作图群体分子标记扩增情况

3.1.1 RAPD引物扩增分析

3.1.2 ISSR引物扩增分析

3.1.3 SRAP引物扩增分析

3.1.4 SSR引物扩增分析

3.2 香菇连锁图谱构建

3.2.1 连锁图分析

3.2.2 构建的连锁图与已有的香菇分子连锁图的比较

4 讨论

4.1 香菇EST-SSR中SSR的组成分布及SSR引物筛选

4.1.1 香菇EST数据库中的SSR

4.1.2 香菇EST-SSR引物筛选

4.2 香菇分子遗传图谱的构建

4.2.1 构图所用分子标记的选择

4.2.2 分子标记引物的扩增结果

4.2.3 分子标记的偏分离

4.2.4 香菇分子遗传图谱

5 小结

5.1 香菇基因组中EST-SSR分析

5.2 香菇EST-SSR引物设计及扩增情况

5.3 RAPD引物扩增情况

5.4 ISSR引物扩增情况

5.5 SRAP引物扩增情况

5.6 香菇分子遗传连锁图构建

第五章香菇部分数量性状的QTL定位

1 引言

2 材料与方法

2.1 构图群体

2.2 遗传连锁图谱构建

2.3 数量性状测定

2.4 QTL定位方法

3 结果与分析

3.1 性状数据的整理与频数分布

3.2 有关发育期的QTL定位

3.3 有关单菇性状的QTL定位

3.4 有关产量性状的QTL定位

3.5 有关双核体菌丝长速和抗木霉活性的QTL定位

3.6有关双核体胞外酶活性的QTL定位

3.7 有关单核体菌丝长速和抗木霉活性的QTL定位

3.8 有关单核体胞外酶活性的QTL定位

3.9 有关单核体菌丝形态的QTL定位

3.10 用MCMC作图方法验证通过CIM作图方法发现的QTL

3.11 MCMC作图方法检测的某些QTL的上位性互作

4 讨论

4.1 香菇双核体性状QTL定位的特殊性

4.2 QTL定位的显著性阀值的确定及QTL的可靠性

4.3 香菇30个性状的QTL定位的总体情况

4.4 QTL成簇分布现象

4.5 QTL长度与QTL精细定位

4.6 单核体菌丝形态性状的QTL定位

5 小结

5.1 香菇QTL定位总体情况

5.2 香菇主要性状QTL的定位

5.2.1 双核体主要性状QTL定位

5.2.2 单核体主要性状QTL定位

5.3 MCMC方法定位结果

5.4 部分QTL的上位性互作

本研究创新点

参考文献

致谢

附录1:在读期间发表的与课题有关的论文

附录2:聚丙烯酰胺凝胶电泳

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