人志贺菌对雏鸡的致病性及人、鸡志贺菌某些重要基因的比较研究

论文摘要

菌痢是由志贺菌引起的一种在全球范围流行的急性肠道传染病,尤其是发展中国家的一个重要的公共卫生问题。志贺菌除可感染人引起痢疾外,还可造成多种动物感染、发病。2004年许兰菊等首次发现鸡志贺菌感染病例,但其与人志贺菌之间的关系尚不清楚。为进一步了解志贺菌尤其是鸡鲍氏志贺菌的分子生物学特性、致病性及其致病性的分子机制,以便弄清鸡鲍氏志贺菌的来源及其在公共卫生方面的意义,本文进行了下列研究并取得预期结果:1.用不同剂量的鸡鲍氏、人鲍氏和人福氏志贺菌通过腹腔注射人工感染1日龄雏鸡。结果发现后两者均能引起雏鸡发病和死亡,且有拉血痢的典型症状出现。证明人志贺菌可人工感染雏鸡并引起发病死亡。2.用不同剂量的人福氏志贺菌对雏鸡做同居感染试验,结果显示102个菌即可以引起雏鸡20%的发病。各人工感染试验组和同居自然感染雏鸡均有不同程度的病变发生,剖检病变率达到100%。从各试验组雏鸡体内都回收到了原接种的菌株。由此证明人志贺菌不仅可以感染雏鸡还能造成水平传播,并且在此过程中其毒力大质粒不会很快丢失。此外还发现鸡体可以做为志贺菌的储存宿主,而且志贺菌对鸡的感染与对人的感染存在相类似的情况,即随着年龄的增长对志贺菌的抵抗能力增强。本研究不仅为鸡志贺菌的来源及人-鸡志贺菌之间的关系提供了间接证据,而且证明人禽之间存在交叉感染的可能性。3.将人福氏志贺菌的毒力大质粒与丢失此质粒的鸡志贺菌通过体外培养的方式,可使该质粒转移到丢失自身毒力大质粒的鸡志贺菌中。用不同剂量的毒力大质粒转移菌株通过口服和腹腔注射分别人工感染雏鸡和小白鼠,结果显示感染雏鸡最高发病率为80%,小鼠最高为60%;虽均无死亡,但剖检病变率达100%。从试验动物体内分别回收到原接种菌株。在培养过程中发现志贺菌丢失毒力大质粒后其培养特性发生较大改变,重新获得毒力大质粒则能恢复其大部分培养特性。本研究首次发现人志贺菌毒力大质粒可以在体外转移给鸡志贺菌,且新生成的转移菌株具有一定稳定性和致病性。据此推测在适宜的外界环境中只要有毒力大质粒和丢失毒力大质粒的相近病原菌存在,两者就可能会发生质粒转移,产生一株新的完整的致病菌株。4.通过药敏试验检测了鸡和人鲍氏志贺菌、人福氏志贺菌对12种常用抗生素的耐药情况,发现三株志贺菌均未产生对喹诺酮类药物的耐药性。根据已发表的序列设计了两对引物,分别扩增三株志贺菌的gyrA基因和parC基因,并对其中的耐喹诺酮类决定区（QRDR）进行分析。发现鸡鲍氏和人鲍氏志贺菌的QRDR区的序列没有发生任何碱基的突变,这与药敏试验结果相吻合。而人福氏志贺菌的gyrA基因中却存在83位Ser83（TCG）→Leu（TTG）的突变,由于只有该位点发生了突变,所以还没有出现耐药性表征,这与细菌对喹诺酮类耐药需同时存在GyrA和ParC多个位点突变或其它耐药机制的观点一致;同时在其parC基因中存在58位Ser58（AGC）→Ile（ATC）的突变,该突变点虽与常见的80、84位氨基酸的改变有所不同,却仍在QRDR区域之中。虽然暂时还无法根据这一结果来判断该突变与喹诺酮类耐药性之间的关系,但至少表明该菌株正处在耐药性演变进程之中。其在志贺菌耐药性形成中的确切作用还有待进一步研究。5.利用PCR技术成功地获取了鸡鲍氏志贺菌ipaH基因的6个拷贝片段,并对其进行了序列同源性分析,发现鸡鲍氏志贺菌与美国报道的人鲍氏菌株CP001063在6个拷贝片段的核苷酸序列比较中同源性都是最高的;与国内报道的人鲍氏菌株CP000036在6个拷贝片段的核苷酸序列同源性比较中虽然存在差异,但与除ipaH2之外的5个片段的同源性仅次于CP001063。这一结果更进一步显示了鸡鲍氏志贺菌起源于人鲍氏志贺菌的可能性。此外还选择了人鲍氏和福氏志贺菌的ipaB和ipaC基因为研究对象,对其进行克隆测序分析。结果表明人鲍氏志贺菌（B株）的ipaB基因与已发表的相应序列的同源性为98.3%～99.9%,ipaC基因与已发表的相应序列的同源性为97.8%～100.0%;人福氏志贺菌（F株）的ipaB基因与已发表的相应序列的同源性为98.1%～99.5%,ipaC基因与已发表的相应序列的同源性为97.9%～100.0%。这些结果为以后进一步研究IpaB和IpaC蛋白的表达及其在志贺菌致病过程中的分子机制奠定了基础,如果能够得到可溶的IpaB和IpaC蛋白,研究其系列化特性及免疫学功能,并进行体内外功能研究,就可以更好的研究志贺菌的发病机制。本研究为志贺菌尤其是鸡鲍氏志贺菌的来源、致病性及其更进一步的分子生物学研究提供了一定的理论依据。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 文献综述
• 第一部分 人志贺菌对雏鸡的人工感染及同居感染试验
• 摘要
• 引言
• 1 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 3. 结论与讨论
• 第二部分 人志贺菌毒力质粒体外转移及其对雏鸡和小鼠的致病性试验
• 摘要
• 引言
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 3. 结论与讨论
• 第三部分 鸡和人志贺菌重要基因的克隆与序列分析
• 实验一 鸡和人志贺菌gyrA、parC 基因突变与耐药性关系的研究
• 摘要
• 引言
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 3. 结论与讨论
• 实验二 鸡志贺菌ipaH 基因、人志贺菌ipaB 和ipaC 基因的克隆与序列分析
• 摘要
• 引言
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 3. 结论与讨论
• 参考文献
• ABSTRACT