双孢蘑菇PPO的提取、纯化及特性测定

论文摘要

多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase,PPO）催化的酶促褐变是导致双孢蘑菇（Agaricus bisporus）采后褐变的主要原因。本文依据蛋白质的溶解度、分子大小和所带电荷分别不同,严格控制实验温度,采取3步离心抽提DEAE-Cellulose-52阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶柱层析共5步处理对双孢蘑菇多酚氧化酶进行了分离纯化。经活性、含量检测和SDS-PAGE电泳测定得出,PPO比活为566.57U·mg-1,蛋白产率为0.47%,相对分子质量为27.27kDa,纯化倍数为103.20。原子力显微镜观察显示,双孢蘑菇中的多酚氧化酶属于椭球状蛋白。以邻苯二酚为底物,利用纯化后的双孢蘑菇多酚氧化酶,得出其最适反应的pH为6.8；最适温度为20℃,对热稳定性差,50℃时处理10分钟酶即基本丧失活性；最适底物浓度为0.06mol·L-1;米氏常数Km=0.1072mol·L-1,最大反应速率Vmax=0.0239U·min-1。L-半胱氨酸能在低浓度下对双孢蘑菇多酚氧化酶起到强烈抑制作用,在0.5mmol·L-1时,即可完全抑制其活性；抗坏血酸、醋酸也具有极强的抑制作用,0.20%的抗坏血酸即可达到90%的抑制率,0.15%的醋酸可达到83.7%的抑制率；柠檬酸和氯化钠的抑制作用较弱。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 研究的背景和意义
• 1.2 多酚氧化酶的研究概况和进展
• 1.2.1 多酚氧化酶的分离纯化
• 1.2.2 Bradford染色法测定蛋白含量
• 1.2.3 多酚氧化酶的纯度鉴定和分子量
• 1.2.4 多酚氧化酶的酶学特性
• 1.2.5 多酚氧化酶的分子结构特点
• 1.3 双孢蘑菇多酚氧化酶的研究现状
• 1.4 课题的主要内容和意义
• 第二章 双孢蘑菇多酚氧化酶的提取、纯化及纯度鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 试验材料
• 2.3 试验仪器与药品
• 2.3.1 主要试验仪器与设备
• 2.3.2 试验药品
• 2.4 技术路线
• 2.5 试验方案
• 2.5.1 双孢蘑菇多酚氧化酶粗酶液的制备
• 2.5.2 粗酶液硫酸铵分级沉淀试验
• 2.5.3 粗酶液的层析纯化
• 2.5.4 SDS-PAGE测定PPO纯度和相对分子质量
• 2.5.5 蛋白含量和活性的检测
• 2.5.6 蛋白比活和纯化倍数的计算
• 2.5.7 扫描探针显微镜观测双孢蘑菇PPO结构
• 2.6 结果与分析
• 2.6.1 PPO提纯过程中的褐变控制
• 2.6.2 硫酸铵分级沉淀试验中饱和度的选择
• 2.6.3 PPO提纯过程中的活性检测和含量测定
• 2.6.4 终提取液的PPO纯度检测和相对分子质量测定
• 2.7 扫描探针显微镜观测双孢蘑菇PPO结构
• 2.8 讨论
• 2.9 本章小结
• 第三章 双孢蘑菇多酚氧化酶特性的测定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试验试剂
• 3.2.3 主要仪器与设备
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 PPO活性的测定
• 3.3.2 pH值对PPO活性的影响及PPO最适pH值的测定
• 3.3.3 温度对PPO活性的影响
• 3.3.4 底物浓度与PPO活性的关系
• 3.3.5 抑制剂对PPO活性及褐变的影响
• 3.4 双孢蘑菇多酚氧化酶特性的测定
• 3.4.1 pH值对PPO活性的影响
• 3.4.2 底物浓度与双孢蘑菇PPO活性的关系
• 3.4.3 温度对双孢蘑菇PPO相对活性的影响
• 3.4.4 抑制剂对双孢蘑菇PPO活性的抑制作用
• 3.5 本章小结
• 第四章 总结与展望
• 4.1 双孢蘑菇多酚氧化酶的提取纯化
• 4.2 双孢蘑菇多酚氧化酶的酶学特性
• 4.3 总结
• 4.4 展望
• 攻读硕士学位期间发表的论文及参与的课题
• 致谢
• 参考文献