论文摘要
猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of pigs, TGE）是由冠状病毒科冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）引起的一种猪的呕吐、腹泻和严重脱水为特征的急性、高度接触性传染性肠道疾病,TGEV的疫苗研究是预防该病重要的研究方向,本研究主要进行了减毒沙门氏菌介导TGEV S基因与猪白细胞介素6（pIL-6）基因双顺反子DNA疫苗的构建与免疫原性研究。1. TGEV S基因和pIL-6基因的双顺反子真核表达质粒的构建与鉴定首先,设计TGEV S基因引物和不同酶切位点,以pMD19T-S质粒为TGEV S基因扩增模板,重新构建TGEV S基因的T克隆载体,并将S基因插入双启动子载体真核表达载体pVAXD上的第二个多克隆位点,成功构建了真核表达载体pVAXD-S,对其进行双酶切和PCR鉴定,表明真核载体的TGEV S基因大小为2000bp左右。其次,设计pIL-6引物和不同酶切位点,以pMD19T-IL6为扩增pIL-6基因模板,重新构建了pIL-6基因T克隆载体,然后将pIL-6基因插入构建好的真核表达载体pVAXD-S中并进行鉴定,表明构建的真核表达载体中pIL-6基因大小为500bp左右,成功构建了真核表达载体pVAXD-S-IL6。分别将构建好的2种真核表达载体pVAXD-S-IL6和pVAXD-S通过脂质体转染法转入COS-7细胞中进行真核表达,并分别以RT-PCR和免疫荧光抗体两种种检测方法进行检测。RT-PCR检测真核表达载体pVAXD-S-IL6时,扩增到TGEV S基因2000bp左右和pIL-6基因500bp左右的两条条带,同时对pVAXD-S检测,则可扩增到一条TGEV S基因2000bp左右条带；免疫荧光抗体检测试验结果为pVAXD-S-IL6和pVAXD-S转染孔细胞都能检测到特异性免疫荧光。两种检测结果均证明pVAXD-S-IL6和pVAXD-S在COS-7细胞中得到了良好的表达,为重组沙门氏菌DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。2.减毒沙门氏菌携带TGEV S基因和pIL-6基因DNA疫苗口服免疫的研究重组沙门氏菌构建及鉴定：将构建好的真核表达载体pVAXD-S-IL6和pVAXD-S分别通过电转入法转入减毒沙门氏菌SL7207中,构建重组沙门氏菌SL7207（pVAXD-S-IL6）和SL7207（pVAXD-S）,通过对重组菌进行PCR和双酶切鉴定,SL7207（pVAXD-S-IL6）出现2000bp和500bp左右的条带,SL7207（pVAXD-S）检测出2000bp左右条带,证明成功构建了重组沙门氏菌；对该重组沙门氏菌SL7207（pVAXD-S-IL6）进行稳定性试验,证明该菌在含抗生素培养环境下重组菌中的质粒比较稳定;将小鼠随机分成四组,8只/组,分别灌胃接种免疫SL7207（pVAXD-S-IL6）、SL7207（pVAXD-S）、SL7207（pVAXD）和对照组PBS,灌胃后1-2天,部分小鼠出现精神不振,扎堆食欲降低等现象,灌胃一段时间后小鼠恢复,活动正常,说明该菌该浓度对小鼠是安全的。小鼠分组、免疫及采样：将小鼠随机分成四组,16只/组,小鼠共免疫3次,每次间隔两周,分别灌胃接种SL7207（pVAXD-S-IL6）、SL7207（pVAXD-S）、SL7207（pVAXD）三组接种剂量均为1×109CFU,和对照PBS组接种PBS 0.2ml,在免疫前和免疫后2、4、6周,每组分别摘眼采集3只小鼠血清和完整的小肠,在第四次采样前每组随机选取两只小鼠采集脾淋巴细胞进行Y-干扰素检测。检测抗体的抗原制备：以保存菌pET32a-Sbc BL21（DE3）进行复苏鉴定,表达TGEV S蛋白上38KD左右的B、C抗原决定簇位点,将表达的蛋白进行纯化,对表达的蛋白和纯化后的蛋白进行SDS-PAGE,在38KD左右出现特异性条带,证明TGEVS蛋白正确的得到了表达和纯化。最后以表达纯化的蛋白作为包被抗原检测待检血清和肠道样品,样品检测结果：用以检测小鼠特异性TGEV和沙门氏菌IgG、IgA抗体水平,通过检测发现SL7207（pVAXD-S）,SL7207（pVAXD-S-IL6）成功激发了TGEV和沙门氏菌抗体（P<0.01）。在第4周SL7207（pVAXD-S-IL6） IgA和IgG抗体水平分别为0.195和0.363,SL7207（pVAXD-S）组IgA和IgG抗体水平分别为0.210和0.402,SL7207（pVAXD-S-IL6）组中抗体均低于SL7207（pVAXD-S）组但无明显差异（P>0.05）,但两者抗体水平均显著差异与对照组（P<0.01）；在第6周SL7207（pVAXD-S-IL6） IgA和IgG抗体水平分别为0.253和0.466,SL7207（pVAXD-S） IgA和IgG抗体水平分别为0.210和0.421 SL7207（pVAXD-S-IL6）组两中抗体均高于SL7207（pVAXD-S）组,其中前者IgA抗体极显著差异于后者（P<0.01）,IgG抗体则显著差异于后者（P<0.05）,与对照组比较均有显著差异（P<0.01）。同时,第6周采集样品前,脾淋巴细胞检测γ-干扰素水平,检测结果显示SL7207（pVAXD-S）, SL7207（pVAXD-S-IL6）γ-干扰素浓度（约为1100pg/ml左右）高于SL7207（pVAXD）和PBS免疫组浓度（约为700 pg/ml左右）。