论文摘要
背景肝星状细胞（HSCs）激活是肝纤维化进程中的核心事件,近来研究发现HSCs具有抗原递呈功能并可调控CD4+T细胞应答。CD4+T细胞对肝纤维化进程具有重要的免疫调控作用,并因其亚群多样性的存在可对肝纤维化进程产生不同的影响。调节性T细胞（Treg）及T辅助细胞17（Th17）是新发现的CD4+T细胞亚群,二者在分化发育早期均需要细胞因子TGFβ1,但其晚期分化发育途径相互拮抗且免疫功能截然相反（前者诱导免疫耐受,后者介导免疫炎症反应）,近年来已有Treg/Th17稳态概念的提出。乙肝肝纤维化进程中是否存在Treg/Th17稳态的偏移、HSCs与Treg/Th17稳态之间是否存在双向调控及这种免疫调控在肝纤维化进程中的作用尚不明确。方法1.乙肝肝纤维化进程中的CD4+T细胞稳态评估：分离慢性乙型肝炎（CHB）及乙肝后肝硬化（LC）患者外周血单个核细胞（PBMC）,并收集部分CHB患者肝穿刺组织标本,采用多色流式细胞术（指标包括CD4、CD25、CD28、CCR6、CTLA-4、Foxp3、IL-10、TGF-β、IL-17、IFN-γ及IL-4）分析外周血CD4+T细胞各亚群的比例、表型及CD4+T细胞稳态的偏移情况；采用Real-time PCR法检测CD4+T细胞各亚群特异性转录因子mRNA水平的表达（目的基因包括Foxp3、RORA、RORC、T-bet、GATA3、SATA3、STAT4、STAT5a）,在mRNA水平阐明CD4+细胞稳态的偏移情况；采用免疫组化法分析不同分级分期的慢性乙型肝炎患者肝脏局部RORγt、Foxp3及α-SMA的表达,阐明肝组织局部Treg/Th17稳态的偏移情况。2.肝星状细胞调控Treg/Th17稳态的体外研究：利用TGFβ1、IL-17、LPS刺激人肝星状细胞株（LX-2）, Real-time PCR检测这些刺激物是否可促进LX-2表达调控Treg/Th17分化及功能的相关因子（TGFβ1、IL-21、IL-23及RARα）;利用TGFβ1预刺激的LX-2与LC患者外周血CD4+T共培养,并在共培养过程中添加各种中和性抗体（TGFβ1、IL-21及IL-23中和性抗体）,共培养结束后Real-time PCR检测LX-2是否调控CD4+T细胞亚群特异性转录因子（T-bet、GATA3、Foxp3及RORA）的表达,流式细胞术检测共培养体系中CD4+T细胞稳态偏移情况；并Cell-IQ实时检测细胞增殖情况3.Treg/Th17稳态调控肝星状细胞功能的体外研究：流式细胞术分选LC患者外周血CD4+CD25+T及CD4+CD25-T细胞,利用CD4+CD25+细胞、CD4+CD25-细胞、人重组细胞因子IL-17及IL-17中和性抗体等形成不同形式的Treg/Th17稳态偏移后,与LX-2的共培养,共培养结束后Real-time PCR检测LX-2促纤维化相关基因（MMP2、TIMP2、TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、Smad3）的表达,流式细胞术分析LX-2的细胞凋亡情况,Cell-IQ实时检测细胞增殖情况。结果1)乙肝肝纤维化进程中的CD4+T细胞稳态评估：多色流式细胞术检测结果显示CHB患者外周血Foxp3/CD4、IL-17/CD4及IL-4/CD4比值均显著升高,即Treg、Thl7占CD4+T细胞的比例均显著增加,其中Treg是乙肝肝纤维化进程中唯一持续而显著升高的CD4+T细胞亚群。并且CHB患者PBMC的Foxp3 （Treg）、RORA （Th17）、GATA3 （Th2）及STAT5a （Treg）等CD4+T细胞亚群特异性转录因子mRNA水平也显著升高,其中Foxp3及STAT5a持续增高,与流式检测结果相符。LC组与CHB组患者外周血Foxp3/IL-17比值持续增高,提示在乙肝肝纤维化进程中Treg/Th17稳态向Treg偏移,而Th1/Th2稳态偏移在该进程中并不显著。在CHB组,外周血Foxp3/IL-17比值随着血清HBV病毒载量的增加及慢性肝炎分级分期评分（GS评分）的增加而增加,同时免疫组化结果显示肝脏局部Foxp3/RORγt比值也随着GS评分的增加而增加。而在LC组,外周血Foxp3/IL-17比值伴随肝功能Child分期的增加而增加,差异具有统计学意义。2)肝星状细胞调控Treg/Th17稳态的体外研究：Real-time PCR结果显示,LX-2可促进RORA基因的表达并抑制Foxp3基因的表达,且这种调控作用依赖细胞间直接接触并具有细胞数量依赖效应。TGF-β1、IL-17及LPS等细胞刺激物均可促进LX-2表达TGF-β1、IL-21、IL-23等Th17功能及分化相关的重要基因,同时抑制Treg分化重要调节基因RARa表达。流式细胞术结果进一步证实TGF-β1预刺激的LX-2可显著下调Foxp3/IL-17比值,且这种调控与LX-2分泌的IL-21及IL-23量有关。此外,LX-2还可促进CD4+T细胞在体外的存活。3) Treg/Th17稳态调控肝星状细胞功能的体外研究：Treg/Th17稳态向Th17偏移时可促进LX-2表达TGF-β1、Ⅲ型胶原及基质金属蛋白酶-2等促纤维化相关基因,而该稳态向Treg偏移时则抑制LX-2表达上述基因。上述Treg/Th17稳态对LX-2促纤维化功能的调控分别与IL-8及IL-10的分泌有关。Treg/Th17稳态的失衡不影响LX-2的凋亡。IL-17可促进LX-2分泌促纤维化因子TGF-β1并抑制IL-10的分泌,而CD4+CD25+细胞则促进LX-2分泌IL-10并抑制（?）TGF-β1的分泌。结论在乙肝肝纤维化进程中,外周血及肝组织局部均存在显著的Treg/Th17失衡,表现为Treg/Th17稳态向Treg偏移,而且偏移严重程度可随着血清病毒复制水平、慢性肝炎分级分期评分及肝功能Child分期的增加而加剧。活化的人HSCs细胞株LX-2可通过促进Th17并抑制Treg从而调控外周血淋巴细胞中的Treg/Th17稳态向Th17偏移,而这种失衡状态可显著上调LX-2的促纤维化功能。
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