ALI/ARDS治疗的新途径：肾素-血管紧张素系统

论文摘要

目的由于目前尚无特异有效的治疗方法,急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）和急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome,ARDS）的死亡率一直居高不下。最近,肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system,RAS）引起关注,有证据提示RAS与ALI/ARDS存在重要关联。为系统研究RAS与ALI/ARDS的关系,我们首先建立盲肠结扎穿孔术（Cecal ligation and puncture,CLP）诱导的ALI/ARDS动物模型,以观察ALI/ARDS中RAS系统的变化规律,并通过干预RAS系统观察动物病情和预后的改变;在此基础上,进一步研究RAS药物氯沙坦干预ALI/ARDS炎症反应通路的机制;同时,还观察ALI/ARDS模型的血管内皮细胞超微结构,并在体外实验验证氯沙坦干预人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡的作用。期望通过这一系列的实验,为ALI/ARDS治疗探索新的途径。研究内容和方法第一部分: ALI/ARDS动物模型中RAS系统的变化建立CLP诱导的ALI/ARDS动物模型,在手术后18小时观察小鼠的症状、血气分析、肺湿/干重比（W/D）和肺组织病理等指标;采用免疫组织化学、蛋白质免疫印迹法（Western blotting）和放射免疫等方法研究ALI/ARDS动物模型中RAS系统几种关键酶（ACE、ACE2和AngⅡ）的变化规律。第二部分:RAS药物对ALI/ARDS的影响小鼠ALI/ARDS模型复制成功后,分别给小鼠腹腔注射卡托普利（ACE拮抗剂）、重组小鼠ACE2（recombinant mouse ACE2,rm ACE2）和氯沙坦（AngⅡ的AT1受体阻滞剂）,观察它们对ALI/ARDS动物的影响,在此基础上,着重观察RAS下游阻滞剂氯沙坦对ALI/ARDS的治疗效果。第三部分:氯沙坦治疗ALI/ARDS的可能机制收集假手术组、手术组和氯沙坦组的小鼠肺组织,分别提取肺组织细胞胞浆蛋白和胞核蛋白,采用Western blotting方法检测胞浆IκB-α表达的变化,采用电泳迁移率变动分析实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA）检测胞核中NF-κB的表达变化;另外提取肺组织总蛋白,采用Western blotting方法检测肺组织中丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路的变化（包括ERK1/2、p38和JNK）。第四部分:氯沙坦对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响先用透视电镜观察ALI/ARDS肺血管内皮细胞的变化,提示ALI/ARDS病理变化中存在血管内皮细胞的变化;在此基础上,在体外培养原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,培养成功后先用AngⅡ刺激细胞,采用流式细胞术观察细胞的凋亡率;然后再加入氯沙坦与AngⅡ共同作用于HUVEC,再次测定细胞的凋亡率,评价氯沙坦对血管内皮细胞的保护作用。研究结果第一部分: ALI/ARDS动物模型中RAS系统的变化1、CLP能够诱导小鼠在手术后18小时出现典型的ALI/ARDS改变,手术组较假手术组小鼠肺水含量明显增多（W/D:6.08±0.64 vs 4.38±0.93,P<0.01）,明显缺氧（PaO2:40.8±5.03 vs 72.8±4.32,P<0.01）,氧合指数明显下降（PaO2/FiO2:194.3±23.9 vs 346.7±20.5,P<0.01）,且肺组织病理出现明显的肺损伤改变。2、Western blotting和免疫组化的结果显示,与假手术组比较,ALI/ARDS小鼠肺组织的ACE2表达下降;而ACE则没有明显差异,手术组和假手术组肺组织中ACE蛋白量均很高。3、在ALI/ARDS小鼠肺组织和血浆中AngⅡ的量均明显增高,而且加入相关RAS药物后AngⅡ出现变化;与手术组比较,卡托普利（ACE拮抗剂）和rmACE2（重组小鼠ACE2）都能不同程度的抑制体内AngⅡ的生成（肺,1.58±0.16,1.65±0.21 vs 2.38±0.41;血,178.04±17.87,153.74±10.24 vs 213.38±25.44）。第二部分:RAS药物对ALI/ARDS的影响1、与手术组比较,卡托普利组小鼠肺W/D明显降低（5.35±0.25 vs 6.06±0.22,P﹤0.05）,rmACE2组与手术组的W/D比较虽然无明显统计学差异,但也出现下降趋势（5.61±0.59 vs 6.06±0.22,P=0.096）。相比而言,氯沙坦能更显著的减少ALI/ARDS小鼠肺W/D （5.35±0.25 vs 6.06±0.22,P﹤0.01）。2、氯沙坦改善肺损伤的程度是与其浓度有关的,在5mg/kg至15mg/kg的范围内,ALI/ARDS小鼠的氧合指数和W/D均得到改善,其改善程度随氯沙坦的浓度增加而增加,但当氯沙坦的浓度超过15mg/kg时,氧合指数和W/D反而逐渐变差,氯沙坦浓度为15mg/kg时治疗ALI/ARDS效果最好。3、氯沙坦能抑制ALI/ARDS小鼠血浆中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达,减轻肺损伤,且能一定程度的改善小鼠7天生存率。第三部分:氯沙坦治疗ALI/ARDS的可能机制1、CLP手术诱导的ALI/ARDS小鼠肺组织胞浆中的IκB-α减少,而胞核NF-κB表达明显增强;腹腔注射氯沙坦后,小鼠IκB-α降解程度减少,相应的,细胞核活化的NF-κB也减少了。2、在CLP手术诱导的ALI/ARDS小鼠肺组织中,ERK1/2、JNK和p38的磷酸化明显增强,而增加氯沙坦后MAPK磷酸化得到不同程度的抑制。第四部分:氯沙坦对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响1、CLP诱导的ALI/ARDS小鼠肺血管内皮细胞出现水肿或溶解,核周间隙分离增宽,内皮细胞间连接增宽。2、人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）加入AngⅡ刺激24小时后,细胞凋亡呈浓度依赖型,AngⅡ（10-7mol/l、10-6mol/l、10-5mol/l）的细胞凋亡率分别是7.85%、9.96%和10.4%。加入10-6mol/l氯沙坦后,HUVEC凋亡率得到改善,细胞凋亡率分别变为:7.95%、8.62%、8.67%。结论1、CLP诱导的ALI/ARDS存在RAS系统激活,表现为机体AngⅡ含量明显增加。2、RAS系统中ACE和ACE2对AngⅡ生成有不同的调节作用,ACE起正调节作用而ACE2起负调节作用;卡托普利和rmACE2都能在一定程度上减少AngⅡ的分泌,改善肺损伤。3、AngⅡ的AT1受体阻滞剂氯沙坦能够明显改善CLP诱导的ALI/ARDS症状,减轻肺损伤,并能提高7天生存率。4、氯沙坦治疗ALI/ARDS的可能机制:干预NF-κB和MAPK信号通路,减轻ALI/ARDS的全身性炎症反应。5、CLP诱导的ALI/ARDS小鼠出现血管内皮细胞损伤;氯沙坦可能通过影响血管内皮细胞的凋亡,减轻血管渗透性,发挥其治疗ALI/ARDS的作用。6、肾素-血管紧张素系统可能是治疗ALI/ARDS的新途径。

论文目录

• 英文缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分：ALI/ARDS 动物模型中 RAS 系统的变化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分：RAS 药物对 ALI/ARDS 的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分：氯沙坦治疗 ALI/ARDS 的可能机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分：氯沙坦对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 在校期间发表文章
• 致谢