通过外显子重复和重排构建“双中心”溶菌酶

论文摘要

外显子重复和重排是导致新基因产生的重要方式。本研究以人溶菌酶为模型,通过体外外显子重复和重排构建“双中心”酶。人溶菌酶（EC 3.2.1.17）是一种重要的药用酶,其二聚体具有明显的抗HIV功能（水解病毒多糖）。该酶成为基因结构与蛋白质结构关系研究的典型实例,稳定性相当高。它有四个外显子,外显子2为氨基酸28-82编码,其包括催化中心的残基（Glu35和Asp53）和结合寡糖底物的一簇氨基酸。在第二和第三外显子表达产物之间存在一突环。我们将重复和重排第二外显子（这里的重排是指密码子重排）插入到突环中,构建了“双中心”溶菌酶基因,通过表达获得了“双中心”溶菌酶。活性检测结果表明外显子重复溶菌酶（RD-L）的相对活性是野生型的181.5%,外显子重排溶菌酶（RA-L）约为107.2%。“双中心”溶菌酶的稳定性与野生型相似。我们采用定点突变技术,结合计算机模拟结果,显示RD-L确实存在两个活性中心,而RA-L只存在一个活性中心。 综上,我们通过外显子重复构建出了“双中心”溶菌酶。这为工程酶的活性中心提供新的理论、策略和捷径,可能具有普遍的指导意义。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 溶菌酶简介
• 1.3 研究意义
• 第二章 实验仪器与试剂
• 2.1 仪器与试剂
• 2.2 菌株和质粒
• 第三章 “双中心”溶菌酶的表达
• 3.1 实验材料及原理
• 3.2 “双中心”溶菌酶基因的构建
• 3.3 “双中心”溶菌酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9
• 3.4 “双中心”溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达
• 3.5 “双中心”溶菌酶基因克隆到大肠杆菌表达载体pET21a（+）
• 3.6 “双中心”溶菌酶基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.7 包涵体的变性复性研究
• 3.8 目的蛋白的分离纯化
• 3.9 “双中心”溶菌酶的活性分析
• 3.10 实验结果与讨论
• 第四章 “双中心”溶菌酶双活性中心的确定
• 4.1 实验材料及原理
• 4.2 “双中心”溶菌酶基因突变体的构建
• 4.3 “双中心”溶菌酶基因突变体克隆到大肠杆菌表达载体pET21a（+）
• 4.4 “双中心”溶菌酶突变体在大肠杆菌中的诱导表达
• 4.5 “双中心”溶菌酶突变体的纯化
• 4.6 “双中心”溶菌酶突变体活性分析
• 4.7 实验结果与讨论
• 第五章 “双中心”溶菌酶酶学性质及结构与功能研究
• 5.1 “双中心”溶菌酶的酶学性质
• 5.2 “双中心”溶菌酶抗菌谱的研究
• 5.3 “双中心”溶菌酶的结构与功能研究
• 5.4 实验结果与讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表的论文
• 摘要
• ABSTRACT