论文摘要
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, TB）是一种具有致病性的病原菌,它所引起的具有传染性的结核病已成为对人类健康最大威胁之一。目前,由于多重耐药性菌株的出现,使结核病的发病率在全球范围内呈上升趋势。因此,当前寻找能有效对抗这种病原菌的药物靶点,并以此来研发新型抗结核病药物已成为试图控制结核病蔓延的研究重点。分枝杆菌细胞壁的核心结构mAGP （mycolic acid, arabinogalactan, peptidoglycan）由分枝菌酸,聚阿拉伯半乳糖（AG）和肽聚糖（PG）构成。其中,肽聚糖是维持菌体细胞形态和渗透压平衡的结构基础。肽聚糖是N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸交替连接形成的多糖链再与短肽交叉连接形成的网状大分子结构。其中,N-乙酰胞壁酸以UDP-乙酰胞壁酸作为糖基供体,而UDP-乙酰胞壁酸的合成途径由两个酶（MurA和MurB）催化完成。在哺乳动物中不存在N-乙酰胞壁酸,所以,不存在UDP-乙酰胞壁酸代谢途径。因此,MurA和MurB可能是抗结核药物的作用靶点。本课题组已鉴定了结核分枝杆菌Rv1315是编码UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶（MurA）的murA基因,催化UDP-乙酰胞壁酸生成的第一步反应。为了研究murA基因对分枝杆菌生长相关性,本课题利用与结核分枝杆菌具有相同细胞壁结构,但无致病性的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis, Msm） mc2155作为实验模型,构建murA基因敲除菌株。本论文的研究目的:（1）采用同源重组插入突变的方法构建耻垢分枝杆菌murA基因敲除菌株;（2）在不同条件下对该菌株进行培养,绘制该菌株生长曲线,从而确定murA基因对分枝杆菌生长的相关性。本论文获得的结果:1. Msm murA基因的扩增与克隆利用PCR （polymerase chain reaction）技术从mc2155基因组中扩增Msm murA基因及其上游约463 bp的DNA序列,并将其连接到pMD18-T的克隆质粒上,构建出pMD-Msm murA。经DNA序列测定,将测序结果与已知的Msm murA基因进行相似性比较,结果显示出扩增的基因为目的基因。2.条件性复制质粒pPR27-Msm murA::kanR的构建将来自于pUC4K的kanR抗性片段插入到克隆质粒pMD-Msm murA中的特定位点,产生Msm murA::kanR突变基因。再将Msm murA::kanR突变基因克隆到pPR27-xylE质粒,从而构建出条件性复制质粒pPR27-Msm murA::kanR,该质粒具备pPR27-xylE质粒的性质。3.营救质粒pCG76-Mtb murA的构建从本实验室构建的pET29b-Mtb murA质粒中获得M. tuberculosis murA基因,将该基因插入到pET23b-Phsp60质粒中,获得Phsp60-Mtb murA片段。将该片段克隆到pCG76质粒,从而构建出营救质粒pCG76-Mtb murA,该质粒具备pCG76质粒的性质,Mtb murA基因的表达受Phsp60启动子控制,用于补偿murA基因敲除菌株中murA的功能和确定murA基因对分枝杆菌生长的相关性。4.发生第一次同源重组的突变菌株mc2155 murA TW-1的筛选将条件性复制质粒pPR27-Msm murA::kanR电转化到mc2155感受态细胞中,根据pPR27-Msm murA::kanR质粒在30°C条件下能复制,而在42°C条件下不能复制的性质,利用温度压力在42°C条件下培养携带pPR27-Msm murA::kanR质粒的mc2155菌株。利用Southern blotting及PCR的方法筛选发生第一次同源重组（pPR27-Msm murA::kanR质粒与mc2155基因组之间）的mc2155 murA TW-1菌株。5.发生第二次同源重组的突变菌株mc2155 murA TW-2 （即murA基因敲除菌株）的筛选将营救质粒pCG76-Mtb murA电转化到mc2155 murA TW-1感受态细胞中,在30°C条件下,利用含10%蔗糖的选择性LB培养基培养mc2155 murA TW-1/pCG76-Mtb murA,在蔗糖选择压力下,用Southern blotting及PCR的方法筛选发生第二次同源重组（mc2155 murA TW-1基因组之内）的菌株mc2155 murA TW-2,即murA基因敲除菌株。在30°C条件下,营救质粒pCG76-Mtb murA可以在murA基因敲除菌株中表达出Mtb MurA蛋白质,从而补偿缺失murA基因的功能。6.生长曲线的测定在30°C和42°C条件下,每隔24小时测定murA基因敲除菌株在595 nm处的光吸收值,并绘制生长曲线。以野生型M. smegmatis作为对照组。实验结果表明对照组在30°C和42°C条件下均能生长;而murA基因敲除菌株仅能在30°C条件下生长,在42°C条件下不能生长,从而说明murA基因是分枝杆菌生长必需基因。7.温度转换后生长曲线的绘制将murA基因敲除菌株接种到含相应抗生素（30°C:Kan和Str;转换42°C:Kan）和0.05 % Tween 80的LB液体培养基中,先在30°C振荡培养至一定浓度时,将只含有Kan的培养基转移到42°C生长;另外,含有Kan和Str的培养基继续在30°C培养作为对照。每24小时测定细菌在595 nm处的吸光度值,绘制细菌的温度转换生长曲线。温度转换生长曲线结果进一步说明murA基因是分枝杆菌生长生长必需基因。结论:本研究利用与结核分枝杆菌具有相同细胞壁结构,但无致病性的耻垢分枝杆菌mc2155菌株作为实验模型,利用同源DNA重组技术构建了murA基因敲除菌株。根据其在30°C和42°C的生长曲线,确定了murA基因是分枝杆菌生长必需基因;温度转换生长曲线的结果也进一步确定了murA基因为分枝杆菌生长所必需的基因。
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