CTNNAL1表达的应答性调控及其在哮喘及气道上皮中的作用

论文摘要

目的:关于哮喘发病机制,气道上皮缺陷理论已成为主流观点之一。哮喘的病理特征之一表现为支气管上皮损伤、脱落,提示哮喘患者的气道上皮对损伤应激的修复反应可能出现缺陷。已知上皮细胞通过表达不同类型的粘附分子实现“粘附”和“锚定”是发挥正常功能的先决条件。国内外及本实验室多项研究证实,粘附分子在气道炎症及损伤修复中发挥重要作用。为了确定与哮喘易感性相关的粘附分子表达特征,本实验室在先前的研究中应用基因芯片及生物信息学方法筛选了人外周血差异表达粘附分子,发现连环素（catenin）家族中的CTNNAL1（catenin alpha-like 1）基因在哮喘病人中表达下调。由于目前对于CTNNAL1功能意义的直接研究极少,其在支气管上皮及肺组织中的作用尚未见报道。本课题围绕CTNNAL1与哮喘发病的关系、CTNNAL1对支气管肺组织功能的影响及CTNNAL1基因表达调控进行了一系列研究。方法与结果:1) CTNNAL1与哮喘相关性分析本实验室在先前的研究中应用基因芯片及生物信息学方法筛选了人外周血哮喘差异表达粘附分子,结果显示多个基因表达水平改变。本研究选择在所有哮喘病人中均下调的CTNNAL1（catenin alpha-like1）基因,应用荧光定量RT-PCR进一步证实结果的可靠性;收集正常人及哮喘病人的支气管粘膜,并构建经典的OVA致敏的小鼠哮喘模型,探讨CTNNAL1在支气管肺组织的分布情况及其与哮喘的关系。荧光定量RT-PCR结果显示成年哮喘病人与正常成年人相比CTNNAL1表达水平明显降低。哮喘儿童病人CTNNAL1表达水平似比正常儿童低,但P＞0.05,尚不能认为有统计学意义,需扩大样本量进一步证实。免疫组化和原位杂交显示,CTNNAL1广泛分布于支气管柱状纤毛细胞、细支气管分泌细胞、间质细胞、血管内皮细胞及肺泡上皮细胞。CTNNAL1在哮喘病人支气管粘膜及哮喘模型小鼠的支气管肺组织表达均下调,哮喘模型组小鼠气道阻力显著高于正常组,且CTNNAL1 mRNA水平与气道阻力呈负相关。以上结果证实CTNNAL1与哮喘发病相关。2) CTNNAL1在气道上皮中的生物学效应本实验利用吸入臭氧建立Balb/c小鼠支气管肺组织应激损伤模型。结果显示,臭氧应激导致明显的杯状细胞增生和上皮缺损。原位杂交实验和荧光定量RT-PCR显示臭氧应激可上调小鼠支气管肺组织CTNNAL1 mRNA表达,于应激的第二天达到高峰,但是随着臭氧应激时间的延长,CTNNAL1 mRNA表达缓慢下降。培养的人BEC细胞株爬片细胞原位杂交显示,未受臭氧应激组BEC阳性细胞数较少,胞浆呈浅黄色,臭氧攻击培养的人BEC 30 min后,阳性细胞数明显增多,染色明显加深,呈深黄色。荧光定量RT-PCR结果与原位杂交一致。提示CTNNAL1参与BEC应激反应,其表达水平受应激调控。为阐明CTNNAL1在急性应激下上调的功能意义,我们利用CTNNAL1表达质粒和CTNNAL1反义寡核苷酸（ASO）建立CTNNAL1高表达或阻抑手段,籍此观察CTNNAL1在气道上皮中的生物学作用。损伤修复测定采用机械损伤在融合的支气管上皮细胞单层上造成一小面积不规则缺损,用显微视频分析系统每隔4h测量缺损面积一次,绘制时间与修复面积的直线回归方程,直线的斜率为损伤修复指数,斜率越大,损伤修复速度越快。增殖采用MTT法。结果显示CTNNAL1可促进细胞的损伤修复和增殖。CTNNAL1 mRNA在损伤修复边缘的活跃细胞高表达,有利于上皮细胞的修复。我们还初步观察了CTNNAL1在细胞外基质纤维连接蛋白（Fibronectin,Fn）激活与细胞迁移运动有关的激酶中的作用。利用Western blot技术观察到CTNNAL1 ASO单独处理不影响FAK磷酸化,但CTNNAL1 ASO处理可降低Fn促FAK磷酸化效应,提示CTNNAL1在Fn促损伤修复与增殖效应的FAK磷酸化途径中发挥作用。以上结果提示CTNNAL1参与维持气道上皮的完整性,CTNNAL1表达下调可能导致上皮功能缺陷及完整性破坏,从而与哮喘发病相关。我们认为,急性应激条件下CTNNAL1表达上调是一种保护性应答,哮喘病人可能出现了这种应答机制的缺陷。3) CTNNAL1基因表达调控研究为了进一步认识CTNNAL1基因表达调控机制,本研究对CTNNAL1的转录因子调节谱进行筛选。利用启动子分析软件PromoterScan和Transfac对CTNNAL1基因5′非编码区进行分析,推测启动子所在范围在-552～-152 from ATG。TESS软件（Transcription ElementSearch System）分析该区域内可能的转录因子结合位点,据此设计8条探针,覆盖所有的转录因子结合位点,应用凝胶阻滞电泳（electrophoretic mobility shift assays,EMSA）筛选调控CTNNAL1表达的转录因子,结果显示探针1,2,3,5,8有与蛋白结合形成的滞后带,能被100倍未标记探针所竞争,为特异性结合。通过突变探针结合试验、抗体超迁移试验,证实与探针结合的转录因子分别为LEF-1、AP-2α和CREB。染色质免疫共沉淀实验显示,LEF-1和AP-2α可特异性与CTNNAL1启动子结合。紧接着,我们用基因定点突变技术观察LEF-1和AP-2α对CTNNAL1启动子活性的影响,结果显示LEF-1与AP-2α的结合位点突变后,CTNNAL1启动子活性下降。进一步,我们用EMSA观察到LEF-1与AP-2α在臭氧应激30min后的活化情况,结果显示臭氧应激后LEF-1活化增加,在应激后1h达到高峰,AP-2α的活化发生在0-1h之间,于应激后30 min达到高峰。CTNNAL1 mRNA的表达与两种转录因子的激活一致。提示在臭氧应激条件下,LEF-1与AP-2α特异性与CTNNAL1结合,共同调控CTNNAL1的表达。结论:LEF-1与AP-2α特异性与CTNNAL1结合,共同调控CTNNAL1的表达。急性应激条件下CTNNAL1表达上调,促进支气管上皮细胞损伤修复与增殖,参与维持气道上皮的完整性。CTNNAL1在哮喘病人及哮喘模型小鼠表达下调,可能导致上皮功能缺陷及完整性破坏,从而与哮喘发病相关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 第二章 CTNNAL1与哮喘相关性分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 病例
• 2.1.4 荧光定量RT-PCR检测哮喘病人外周血CTNNAL1表达水平
• 2.1.5 免疫组化检测人支气管粘膜CTNNAL1水平
• 2.1.6 哮喘动物模型的制备
• 2.1.7 肺功能检测
• 2.1.8 支气管肺泡灌洗（bronchoalvage lavage,BAL）
• 2.1.9 肺组织病理变化
• 2.1.10 原位杂交检测肺组织CTNNAL1 mRNA的表达
• 2.1.11 荧光定量RT-PCR检测小鼠肺组织CTNNAL1表达水平
• 2.1.12 统计学处理
• 2.2 结果
• 2.2.1 哮喘病人外周血白细胞CTNNAL1表达下调
• 2.2.2 哮喘病人支气管粘膜CTNNAL1表达降低
• 2.2.3 哮喘动物模型检测
• 2.2.4 CTNNAL1在小鼠支气管肺组织的表达
• 2.2.5 小鼠支气管肺组织CTNNAL1表达水平与气道阻力相关
• 2.3 讨论
• 第三章 CTNNAL1在气道上皮中的生物学效应
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 臭氧应激的气道高反应动物模型的制备
• 3.1.4 荧光定量RT-PCR检测应激动物支气管肺组织及人支气管上皮细胞株CTNNAL1 mRNA表达水平
• 3.1.5 永生化人支气管上皮细胞株的培养
• 3.1.6 原位杂交检测支气管上皮细胞CTNNAL1 mRNA的表达
• 3.1.7 CTNNAL1绿色荧光蛋白表达载体的构建
• 3.1.8 生物信息学分析CTNNAL1细胞内定位,荧光显微镜观察验证
• 3.1.9 反义寡核苷酸（ASO）设计
• 3.1.10 人支气管上皮细胞转染
• 3.1.11 测量BEC的损伤修复指数RI[4,59]
• 3.1.12 细胞活性测定
• 3.1.13 Western blot检测细胞FAK磷酸化
• 3.1.14 统计学处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 CTNNAL1在应激的小鼠支气管肺组织及培养的人BEC表达上调
• 3.2.2 pEGFP/CTNNAL1表达载体的鉴定
• 第四章 CTNNAL1基因表达调控研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 细胞培养
• 4.1.3 凝胶阻滞电泳（Electrophoretic mobility shift assays,EMSA）
• 4.1.4 染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）
• 4.1.5 荧光定量RT-PCR
• 4.1.6 基因定点突变
• 4.1.8 统计分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 核转录因子对CTNNAL1的表达调控的体外筛选
• 4.2.2 核转录因子对CTNNAL1的表达调控的体内验证
• 4.2.3 LEF-1与AP-2α结合位点突变对荧光素酶活性的影响
• 4.2.4 臭氧应激的BEC LEF-1和AP-2α的活性检测
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 在读期间主要的研究成果