产溶菌酶菌株的筛选和鉴定以及溶菌酶基因的克隆和表达

论文摘要

N-乙酰胞壁质酶可以选择性的水解细菌细胞壁肽聚糖结构中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键。来源于微生物的溶菌酶除了具有β-1,4 N-乙酰胞壁质酶活力外,还具有β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶活力,能够水解鸡卵清溶菌酶等其它类型的溶菌酶无法水解的氧乙酰化的细胞壁,具有更为广泛的溶菌谱和潜在的应用价值。本研究应用双层平板从土壤中筛选得到四株能溶解金黄色葡萄球菌细胞壁的放线菌,通过16S rDNA鉴定:三株为链霉菌,分别是Streptomyces exfoliatus、Streptomyces graminearus以及Streptomyces koyangensis,另一株为Kribbella sp.。由于不同来源的溶菌酶具有不同的生理生化性质,其实际应用价值也有所差异,本论文拟从四株菌中克隆N,O-二乙酰胞壁质酶基因并进行原核表达以便获得具有医药应用价值的溶菌酶。利用一系列胞壁质酶同源序列进行Clustalw比对,在保守区设计CODEHOP引物,采用温度梯度PCR程序,通过两轮PCR反应扩增胞壁质酶保守区,所得产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收并连接至载体pMD18-T,转化大肠杆菌DH5α,对转化子进行筛选并进行测序分析。结果表明,克隆获得序列与在线设计引物时所选的序列的保守区同源性不是很高,可能有潜在的应用价值。根据CODEHOP扩增得到的基因片段设计嵌套引物,应用TAIL-PCR技术扩增溶菌酶基因保守区的5’端和3’端的序列,拼接得到溶菌酶基因的全长序列。分析核苷酸序列所对应的氨基酸序列,获得了该酶的一些特性,如等电点、分子量等。设计引物扩增某一种筛选菌种溶菌酶成熟肽编码区（不含信号肽序列）,在引物的3’端和5’端分别引入NcoⅠ和XhoⅠ位点。将扩增得到的某一株菌的溶菌酶成熟肽编码区连入表达载体pET-26b（+）,获得重组表达质粒pET-26b-x,重组质粒转化表达宿主菌E coli BL21（DE3）pLysS,筛选重组E.coli BL21（DE3）pLysS-pET-26b-x工程菌株,并对重组工程菌株经IPTG进行了诱导表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 溶菌酶的研究进展
• 1 溶菌酶的作用机理、应用及分子生物学研究
• 1.1 溶菌酶的催化机制
• 1.2 溶菌酶的应用
• 1.2.1 溶菌酶在食品工业中的应用
• 1.2.1.1 溶菌酶作为添加剂的应用
• 1.2.1.2 溶菌酶营养、保健功能方面的应用
• 1.2.2 溶菌酶在酶工程上的应用
• 1.2.3 溶菌酶在医药方面的应用
• 1.2.4 溶菌酶在农业上的应用
• 1.3 溶菌酶的分子生物学研究
• 2 N,0-Z-乙酰胞壁质酶的性质研究
• 2.1 N,0-二乙酰胞壁质酶的生化性质
• 2.2 N,0-二乙酰胞壁质酶的分子生物学
• 3 本课题立题依据及前景分析
• 第二章 产溶菌酶菌株的筛选及16S RDNA的鉴定
• 1 实验材料
• 1.1 菌株、质粒及遗传特性
• 1.2 主要试剂及培养基
• 2 实验方法
• 2.1 土样的采集及处理
• 2.2 产溶菌酶菌株的筛选
• 2.3 菌体基因组DNA的提取
• 2.4 PCR克隆基因组16S rDNA与序列分析
• 2.4.1 PCR扩增基因组16S rDNA
• 2.4.2 连接反应
• 2.4.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.4.4 转化反应
• 2.4.5 重组质粒的筛选,鉴定及测序
• 3 结果与讨论
• 3.1 土样的选择
• 3.2 筛选得到的结果
• 3.3 提取基因组DNA的实验结果
• 3.4 PCR的电泳试验结果
• 4 本章小结
• 第三章 溶菌酶保守区的克隆
• 1 实验材料
• 1.1 菌株、质粒及来源
• 1.2 工具酶及试剂
• 2 CODEHOP PCR技术克隆溶菌酶基因的部分序列
• 2.1 用于克隆放线菌溶菌酶基因保守区序列的CODEHOP引物设计
• 2.2 CODEHOP PCR扩增部分溶菌酶基因序列
• 2.2.1 CODEHOP PCR反应条件
• 2.2.2 CODEHOP PCR反应程序
• 2.2.3 CODEHOP PCR产物TA克隆、序列测定及筛选
• 3 结果与讨论
• 3.1 CODEHOP PCR设计引物注意的问题
• 3.2 CODEHOP PCR试验结果
• 3.3 溶菌酶基因保守区核苷酸序列的在线比对及相互比对结果
• 4 本章小结
• 第四章 全长溶菌酶基因的克隆及序列分析
• 1 材料
• 1.1 菌体与载体
• 1.2 工具酶和试剂
• 2 方法
• 2.1 TAIL-PCR扩增溶菌酶基因保守区段的上下游序列
• 2.1.1 用于TAIL-PCR的AD引物序列
• 2.1.2 用于TAIL-PCR的上下游的特异性引物
• 2.2 TAIL-PCR巢式引物的设计
• 2.3 TAIL-PCR的反应体系和反应条件
• 2.4 TAIL-PCR产物的回收及序列分析
• 3 试验结果及讨论
• 3.1 TAIL-PCR AD引物的设计
• 3.2 TAIL-PCR反应注意的问题
• 3.3 TAIL-PCR产物的特点
• 3.4 溶菌酶基因全序列的拼接和分析
• 3.4.1 拼接序列
• 3.4.2 克隆得到的溶菌酶基因与其编码的蛋白质分析
• 4 本章小结
• 第五章 溶菌酶基因在大肠杆菌中的表达及重组溶菌酶活性鉴定
• 1 材料
• 1.1 菌株与载体
• 1.2 培养基、工具酶及试剂
• 2 PCR扩增某一株菌溶菌酶基因的成熟肽部分
• 2.1 重组质粒的构建及鉴定
• 2.2 重组质粒转化E.coli BL21（DE3）pLysS及筛选
• 2.3 重组溶菌酶的酶学性质分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 基因克隆至pET-26b（+）载体
• 3.2 溶菌酶基因克隆至pET-26b（+）载体
• 3.3 重组溶菌酶的酶学性质分析
• 4 小结
• 下一步的工作计划
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 学位论文评阅及答辩情况表