论文摘要
目的:胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）作为一种典型的脑肠肽（brain-gut peptide）在神经系统功能的调节中起着重要的作用,揭示其在神经元中的信号转导将对了解脑的结构与功能、某些中枢神经系统疾病的发病机理具有重要意义,因而近年来已成为备受关注的领域。本研究采用神经元体外培养、Western Blotting、MTT检测等方法,探讨八肽胆囊收缩素（octa-peptide cholecystokinin,CCK8）与表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）在神经元信号转导中交叉对话（cross talk）的可能机理,进而从神经元生长活性的角度,观察CCK8与EGF协同作用的功能效应。即用不同类型CCK受体的特异性抑制剂处理神经元,分析CCK8刺激表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）磷酸化的受体类型;采用钙离子鳌合剂EGTA处理神经元,确定Ca2+是否参与了CCK与EGF信号转导的cross talk;观察培养的小鼠神经元经CCK8、EGF刺激一定时间后,对细胞活性的影响,为探讨小鼠神经元中CCK和EGF之间的相互作用提供实验依据。方法:（1）培养的乳小鼠神经元分为对照组、CCK8刺激组、CCK8+ L364 718（CCKA受体拮抗剂）组、CCK8+L365 260（CCKB受体拮抗剂）组和CCK8+ L364 718+ L365 260组,各组细胞培养7d后,倾去培养液,加入无血清的DMEM培养基在37℃孵育30min。刺激组给予CCK8（10-7mol/L）,对照组给予等量的DMEM培养基,作用5min后,倾去培养基,液氮终止反应,裂解神经元提取细胞总蛋白,Bradford法测定蛋白含量,SDS-PAGE电泳分离,Western Blotting检测磷酸化表皮生长因子受体（phospho-epidermal growth factor receptor,p-EGFR）蛋白的表达;受体拮抗剂组在分别给予不同拮抗剂（10-8mol/L）作用10min后再给予CCK（810-7mol/L）作用5min,余操作同上。根据Western印迹膜上p-EGFR蛋白条带灰度,采用Quantity One分析软件进行处理,对不同CCK受体拮抗剂作用后EGFR磷酸化水平的改变进行了分析。（2）将神经元分为对照组、CCK8组、CCK8+EGTA(特异性Ca2+鳌合剂)组,各组细胞倾去培养液,加入无血清的DMEM培养基在37℃孵育30min。对照组及CCK8刺激组处理同（1）,Ca2+鳌合剂组首先给予Ca2+鳌合剂EGTA（3mmol/L）作用5min后再给予CCK8（10-7mol/L）,作用5min,余操作同（1）,采用Quantity One分析软件对Western印迹图谱进行分析处理,比较EGFR磷酸化水平的改变。（3）将96孔板中培养的神经元分为对照组、CCK8刺激组、EGF刺激组、CCK8+EGF刺激组,每组设3复孔,对照组加入普通培养基,CCK8刺激组给予CCK8（10-7mol/L）,EGF刺激组给予EGF（40μg/L）,CCK8+EGF刺激组给予CCK8（10-7mol/L）+ EGF（40μg/L）,分别作用24、48、72、96h后,光镜下观察神经元的生长状况,用MTT法检测细胞的活性。结果:（1）分别采用CCKA型、CCKB型受体拮抗剂作用于神经元,结果表明,加入A型受体特异拮抗剂L364 718后,EGFR蛋白的磷酸化水平明显降低,加入B型受体特异拮抗剂L365 260后,EGFR蛋白的磷酸化水平略有降低,但其作用较L364 718弱;而同时使用两种抑制剂可导致EGFR蛋白磷酸化水平更为明显的降低,提示皮质神经元中CCK的两种类型受体均介导了CCK8刺激EGFR磷酸化的效应,但CCKA型受体可能发挥了主导作用。（2）采用EGTA处理神经元降低细胞内Ca2+后,结果显示,EGFR的磷酸化水平未见明显改变,表明CCK8刺激EGFR磷酸化可能未涉及Ca2+信使途径。（3）功能学研究显示:显微镜下观察可见,神经元在培养9d后,未经刺激的对照组神经元贴壁数量相对减少,部分神经元胞体变大变圆,突起断裂,细胞呈现老化趋势;而CCK8刺激组、EGF刺激组、CCK8+EGF刺激组的神经元生长旺盛,胞体丰满,折光性强,表现出较好的生长状态。培养至13d,对照组神经元贴壁数量明显减少,培养液中可见悬浮细胞,而仍然贴壁的神经元胞体肿胀,细胞突起消失,神经元之间的网络松散,瓶底铺满大量胶原,细胞已老化死亡;而其余三组加入刺激剂的神经元才开始呈现老化趋势。MTT测定显示,CCK+EGF刺激可以明显增强神经元的活性（p<0.05）,且其作用较CCK和EGF单独作用效果更为明显。结论:（1）CCKA型、B型受体均介导了CCK8激活EGFR磷酸化的信号转导途径,但A型受体发挥了更为重要的作用;（2）神经元中CCK8刺激EGFR磷酸化的效应中可能未涉及Ca2+信使途径;（3）CCK8、EGF均可提高培养神经元的活性,对神经元有一定保护作用;若二者同时作用则可进一步延长神经元的存活时间和增强其细胞活性,表明CCK8与EGF通过信号转导的cross talk可协同促进小鼠神经元的生长与存活。